重组DNA技术_精品文档.pptx

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DNA重组和重组DNA技术DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology,第二十一章,DNA重组（DNArecombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。

重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。

第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNature,DNA重组,同源重组（homologousrecombination）位点特异的重组（site-specificrecombination）转座重组（transpositionrecombination）接合作用（conjugation）转化作用（transformation）转导作用（transduction）,发生在同源序列间的重组称为同源重组（homologousrecombination），又称基本重组（generalrecombination）。

是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型,一、同源重组是最基本的DNA重组方式,二、位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合,位点特异重组（site-specificrecombination）是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。

三、转座重组可使基因移位,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座（transposition）。

大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。

这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组,

（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用（conjugation）。

可接合质粒如F因子（Ffactor）,细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

质粒,

（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用（transformation）。

例：

溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。

（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用（transduction）。

噬菌体的生活史,溶菌生长途径（lysispathway）溶源菌生长途径（lysogenicpathway）,第二节重组DNA技术,RecombinantDNATechnology,重组DNA技术相关概念,克隆（clone）:

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning），即无性繁殖。

技术水平：

分子克隆（molecularcloning）（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）,其主要过程包括：

在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。

重组DNA技术，又称分子克隆（molecularcloning）或DNA克隆（DNAcloning）或基因工程（geneticengineering）技术,一、重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE）是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。

+,BamH,定义：

与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

、（基因工程技术中常用型）,分类：

作用：

第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。

命名：

Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点回文结构（palindrome）,切口：

平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。

这两个相同的粘性末端称为配伍末端（compatibleend）。

BamH,Bgl,+,+,同尾酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。

+,BamH,+,Bst,同裂酶：

二、重组DNA技术中常用的载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

载体按功能分为克隆载体（cloningvector）表达载体（expressionvector）,克隆载体（cloningvector）为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。

表达载体（expressionvector）为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

（一）克隆载体,至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制；至少有一个选择标志（selectionmarker）：

选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因。

有适宜的RE的单一切点：

载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）。

1.克隆载体应具备的基本特点,

（1）质粒（plasmid）,特点:

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。

2.常用的克隆载体,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,

（2）噬菌体（phage）,M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,（3）其他克隆载体,

（二）表达载体,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。

根据宿主细胞分为：

原核表达载体真核表达载体,1.原核表达载体,原核表达载体的基本组成,R：

调节序列；P：

启动子；SD：

SD序列；TT：

转录终止序列,2.真核表达载体,真核表达载体的基本组成,OriPro：

原核复制起始序列；P：

启动子；MCS：

多克隆位点；TT：

转录终止序列；orieuk：

真核复制起始序列。

第三节重组DNA技术基本原理和操作步骤,基本原理,以质粒为载体的DNA克隆过程,

（一）目的基因的分离获取分,化学合成法要求：

已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA（见第20章）PCR法（见第20章）其他方法（见第20章）,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,从cDNA文库获取目的基因,

（二）载体的选择与构建选,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

目的：

获得某一目的基因或DNA片段获得目的DNA片段所编码的蛋白质,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,（三）目的DNA与载体连接接,方式：

（1）单一相同黏端连接

（2）不同黏端连接（3）通过其他措施产生黏端进行连接,黏端连接,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,单一相同黏端连接,不同黏端连接（定向克隆）,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,适用于：

受体菌条件：

安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）,导入方式：

转化（transformation）转染（transfection）感染（infection）,（四）重组DNA转入受体细胞转,1.借助载体上的遗传标志进行筛选

（1）利用抗生素抗性标志筛选

（2）利用基因的插入失活/插入表达特性筛选（3）利用标志补救筛选（4）利用噬菌体的包装特性进行筛选,（五）重组体的筛选与鉴定筛,2.序列特异性筛选

（1）RE酶切法

（2）PCR法（3）核酸杂交法（4）DNA测序法3.亲和筛选法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,互补筛选（蓝-白筛选）,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：

小结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立：

表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：

选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：

不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体（inclusionbody）；很难表达大量可溶性蛋白。

1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）,优点：

可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：

操作技术难、费时、经济,转染将表达载体导入真核细胞的过程,方法：

磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射,2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,