动物细胞与组织培养技术_精品文档.ppt

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第三章动物细胞与组织培养技术,第一节概述一、动物细胞与组织培养的基本概念二、动物细胞体外培养的特点三、发展历史四、动物细胞的体外培养一般条件（掌握）五、体外培养细胞生物学特性（掌握）第二节动物细胞、组织培养的基本方法（掌握）第三节培养细胞的检测和特性鉴定（掌握）第四节动物细胞体外培养举例第五节细胞同步化（了解）第六节组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）,第一节概述,一、基本概念1动物细胞与组织培养（CellandTissueCulture）：

指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

是动物细胞工程的基础。

分类：

细胞培养组织培养器官培养,2、原代培养（PrimaryCulture）：

亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。

3继代培养（SecondaryCulture）：

亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4、细胞系（cellline）：

由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。

5、细胞株（cellstrain）：

细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。

有限细胞系（infinitedcellline）：

不能连续培养的细胞株。

无限细胞系（finitedcellline）：

能够连续培养的细胞株，也称无限系。

无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。

细胞株、细胞系的命名：

以组织来源定名，如BHK（幼地鼠肾细胞）以人名定名，如HeLa细胞以时间地点来定名，如S7811细胞系以临床疾病类型定名，如BALL-1细胞系（来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞）,用于生产的动物细胞株,原代细胞,二倍体细胞,融合细胞,基因工程细胞,转化细胞,常用细胞株：

CHO细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、WI-38细胞,二、动物细胞体外培养特点动物细胞生长缓慢，培养时间长。

更易受微生物污染（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要防治污染问题。

对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。

包括PH值、温度、剪切力对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。

原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。

总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。

平滑肌细胞,神经元细胞,血红细胞,形态上表现为多种多样，如圆形、椭圆形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多边形等,三、动物细胞培养的发展历史,1885年，WilhelmRoux（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。

并且，他首次采用了“组织培养”一词。

1907年，美国胚胎学家RossHarrison（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。

他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。

1912年,法国学者AlexisCarrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。

在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。

1923年，他设计了卡氏培养瓶。

1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。

1925年，Maximow采用双盖片法。

1934年，Gey和Lewis用旋转管培养了许多细胞系。

相继，人们设计了多种类型的培养瓶。

1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。

他还创建了单个细胞培养方法。

1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。

1952年Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系。

1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。

1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。

且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。

四、动物细胞的体外培养一般条件,1、恒定的温度:

37,维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。

人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。

培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。

低温下会使细胞代谢速率降低,2、pH：

最适为7.27.4,大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6，每种细胞都有其最适pH值.当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。

3、气体,气体：

需要O2、CO2（95%空气、5%CO2）气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.,4、营养：

要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。

5、无菌培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。

当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。

因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

（一）培养细胞的生长方式及类型,

（二）培养细胞的生长特点,（三）培养细胞的生长与增殖过程,五、动物细胞的体外培养生物学特性,贴壁依赖型细胞,非贴壁依赖型,成纤维细胞,上皮型细胞,游走型细胞,多形型细胞,

（一）培养细胞的生长方式及类型,于悬浮状态下即可生长,贴附于支持物表面才能生长的细胞,1、贴壁依赖型细胞含义：

一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。

单层附壁培养：

指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。

在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：

成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞

（1）成纤维细胞型：

本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞；长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。

其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。

如人胚肺细胞。

人的成纤维细胞,小鼠的成纤维细胞,人骨髓间充质细胞（MSC）,大鼠血管平滑肌细胞,成纤维细胞型,成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。

本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名.除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。

人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。

（2）上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。

细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。

生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。

内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。

如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。

Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。

单层扁平上皮细胞,人口腔皮样癌细胞,人宫颈癌上皮细胞（Hela）,成骨肉瘤细胞（多角形）,上皮细胞型,奶牛肾脏上皮细胞（上皮细胞型）,体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。

与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。

取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同。

（3）游走型细胞：

不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。

本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。

细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。

此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。

在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。

如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。

体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。

主要是：

单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。

1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。

3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。

4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。

单核巨噬细胞（未刺激状态）,游走细胞型,单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：

向四周伸展伪足,需要注意的是：

在实际细胞培养中，可能同时存在2种及其以上细胞形态；其影响因素包括

（1）不同来源细胞细胞形态学表现不同；

（2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成分，培养基，温气环境等,（4）多形型细胞：

形态上不规则的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。

如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。

神经细胞（DAB显色）,多形型细胞,神经细胞,大鼠海马神经细胞,2非贴附型细胞悬浮型细胞：

指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。

见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。

胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。

这种细胞的形态特点：

胞体始终为球形。

优点：

生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。

缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。

贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养,实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。

影响细胞形态学特征的因素,血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。

如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞,但在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。

（二）培养细胞的生长特点,贴附和伸展,接触抑制,密度抑制,1贴附贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。

贴附底物：

其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。

一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。

培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。

细胞贴附和伸展过程：

贴附过程：

促细胞附着因子吸附于底物上悬浮的圆形细胞与底物附着细胞将伸展成其原来的形态。

贴附过程,影响细胞的贴附和伸展的因素：

细胞因素；生物因素（如促附着因子）；机械、物理因素（如低温或培养液的流动过快）；其它一些因素的影响（例如：

离子的作用）.可采取的措施：

包被；减少接种时细胞悬液的量；培养液中离子成分及浓度培养液的温度,2接触抑制（Contactinhibition）细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。

一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。

3、密度依赖性（