免疫组织化学检测技术.ppt

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第10讲,免疫组织化学检测技术,基本内容,一、什么是免疫组织化学二、免疫组化的检测原理三、免疫组化的全过程四、几种常见的免疫组化检测技术五、注意事项六、免疫组化技术的应用七、课堂小结八、作业,一、定义,免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。

二、免疫组化的检测原理,在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。

如果组织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可以原位确定组织中或细胞内抗原的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。

组织或细胞中凡是能做抗原或抗体的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

二、免疫组化的检测原理,组织抗原,抗体,1荧光2酶3亲和技术4金标,标记物,标记抗体,二、免疫组化的检测原理,组织抗原,标记的抗原抗体复合物,标记抗体,两种免疫细胞化学反应方法,二、免疫组化的检测原理,直接法,间接法,三、免疫组化的全过程,标本的处理,抗原抗体反应和呈色反应,显微镜下观察结果,抗原的提取与纯化,免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化,标记物与抗体集合形成标记抗体,1、标本的处理组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。

三、免疫组化的全过程,1、标本的处理标本的主要来源：

活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞。

主要包括三部分：

标本的固定与保存制作切片酶消化处理,三、免疫组化的全过程,组织材料的固定目的:

（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。

（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。

（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。

（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。

（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。

三、免疫组化的全过程,标本的固定与保存固定时间：

固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。

三、免疫组化的全过程,标本的固定与保存好的固定剂：

（1）能快速固定抗原

（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应,三、免疫组化的全过程,三、免疫组化的全过程,各种抗原的固定,三、免疫组化的全过程,制作切片：

冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。

酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。

常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。

三、免疫组化的全过程,2、抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。

抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应浅或不着色。

抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。

（效价指某一物质引起生物反应的功效单位）,三、免疫组化的全过程,3、免疫染色（关键步骤）必要性：

组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。

标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；,三、免疫组化的全过程,3、免疫染色对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。

蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。

常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。

三、免疫组化的全过程,3、免疫染色非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。

防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物树脂上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。

三、免疫组化的全过程,免疫组化染色中标识物的选择原则：

用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定,三、免疫组化的全过程,常用标记物荧光素：

最常用的是异硫一氰酸荧光素（荧光显微镜下呈绿色荧光）四乙基罗达明（荧光显微镜下发橙红色荧光）酶：

辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

生物素：

（Biotin）铁蛋白金等：

主要应用于免疫电镜。

其他：

如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）,三、免疫组化的全过程,4、设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。

通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。

（1）阳性对照用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。

（2）阴性对照用不含已知抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。

阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。

三、免疫组化的全过程,5、观察直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）。

三、免疫组化的全过程,三、免疫组化的全过程,6、免疫组化的结果判断免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：

胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。

阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。

阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。

三、免疫组化的全过程,荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术,四、几种常用的免疫组化检测技术,免疫荧光技术将荧光素作为标记物，使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。

荧光素：

作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物。

.异硫氰酸荧光素FITC.四乙基罗达明.四甲基异硫氰酸罗达明.藻红蛋白,四、几种常用的免疫组化检测技术,荧光：

在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失。

荧光显微镜：

荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检标本内的荧光物质发出发射光。

四、几种常用的免疫组化检测技术,海马细胞微管蛋白绿色（胞体、树突）轴突终末蛋白红色（突触）,四、几种常用的免疫组化检测技术,培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色,五、注意事项,1、抗体的保存浓缩抗体：

有效期内，只需放在4冰箱内，保存时间可达1-3年。

即用型抗体：

理论上在4冰箱内可保存半年左右。

PBS或抗体稀释液稀释的抗体：

一般只可放置1-2个月。

2、出现假阳性的原因组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。

出血和坏死：

红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。

抗体的交叉反应。

五、注意事项,3、出现假阴性的原因固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。

固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。

最好使用10%中性福尔马林。

抗体浓度过低。

孵育时间太短，或孵育温度太低。

缓冲液pH值不正确。

五、注意事项,4、必须严格设置阳性对照和阴性对照。

5、DAB（二甲氨偶氮苯）有致癌性，用后不应随处倒弃。

五、注意事项,六、免疫组织化学技术的应用,荧光免疫组织化学技术主要用于病原体感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫组化定位等；在病原生物学方面，主要用于菌种的鉴定和抗原结构的分析；在细胞免疫学检测中，用以检测淋巴细胞表面的各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原和各种膜受体等。

六、免疫组织化学技术的应用,酶免疫组织化学技术主要用于组织切片或其它抗原的定位检测。

组织切片中的各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。

免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜，目前仍较多用于科研分析。

免疫组化在临床病理诊断中的应用标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度;协助肿瘤良恶性的诊断;鉴别低分化癌和肉瘤;鉴别转移癌的性质;协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶;鉴别小细胞恶性肿瘤;癌组织耐药基因的检测;为癌症患者治疗方案的拟定提供依据;确定肿瘤组织的增殖活性;评估癌症患者的预后;检测病原体。

六、免疫组织化学技术的应用,鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤鉴别微小转移癌灶鉴别某些转移癌的类型鉴别低分化癌的类型鉴别低分化肉瘤的类型,六、免疫组织化学技术的应用,七、课堂小结八、作业:

1、免疫组化的原理2、免疫组化的操作流程,O（_）O谢谢,