章核苷酸和核酸.ppt

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第九节第九节DNA的一级结构测定的一级结构测定和化学合成和化学合成一、一、DNA一级结构测定一级结构测定（DNAsequencing）DNA的一级结构的一级结构:

多聚脱氧核苷酸链多聚脱氧核苷酸链中脱氧核苷酸的排列中脱氧核苷酸的排列顺序顺序碱基序列碱基序列DNA碱基顺序测定的主要方法碱基顺序测定的主要方法1975年，年，Sanger加减法加减法1977年，年，Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法1977年，年，Maxam&Gilbert化学断裂法化学断裂法1.双脱氧法双脱氧法（dideoxymethod）或末端终或末端终止法止法（chaintermination）DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.（1977）.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,74,5463-7.asecondNobelPrizeinChemistryin1980DNA的生物合成的生物合成参与参与DNA复制的主要物质复制的主要物质底物底物:

dATP,dGTP,dCTP,dTTP（dNTP）聚合酶聚合酶:

DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）模板（模板（template）:

解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物（引物（primer）:

互补于模板链的寡核苷酸片段，互补于模板链的寡核苷酸片段，提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合子链子链DNA延长的方向延长的方向:

53DNA生物合成的过程生物合成的过程DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸的掺入终止双脱氧核苷酸的掺入终止DNA链的合成链的合成测序体系测序体系*（1-5%）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测*+变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺丙烯酰胺+双丙烯酰胺双丙烯酰胺三维网状孔结构三维网状孔结构变性剂变性剂:

尿素尿素电泳装置电泳装置放射自显影放射自显影利用放射性同位素利用放射性同位素所发射出来的带电粒子所发射出来的带电粒子（或或粒子粒子）作用于感光作用于感光材料的卤化银晶体，从材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可用显影液显示，成为可见的可见的像像。

2.自动测序自动测序HooddevelopedaprototypeautomatedDNAsequencerin1985LeroyHood（1938-）earnedanM.D.FromJohnsHopkinsUniversityin1964andaPh.D.inbiochemistryfromtheCaliforniaInstituteofTechnologyin1968.Hewonthe2003Lemelson-MITPrizeforinventingfourinstruments:

theDNAgenesequenceandsynthesizer,andtheproteinsynthesizerandsequencer2004荧光物质作为标记物荧光物质作为标记物CCGAATGCTGACGTA荧光物质标记双脱氧核苷酸荧光物质标记双脱氧核苷酸theSangerInstituteTeam55:

SequencingFacility3.碱基序列测定的新方法碱基序列测定的新方法（Nextgenerationmethods）美国国家卫生研究院（美国国家卫生研究院（NIH）设立）设立“RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies”基金，目标基金，目标:

2009年，测定一人全基因年，测定一人全基因组序列只组序列只$10万，万，2014年，费用将降为年，费用将降为$1000。

Waston2007年年5月月31日获赠装有他本人完整基因组日获赠装有他本人完整基因组图谱数据的图谱数据的DVD光盘。

（光盘。

（2个月，个月，$200万）万）基因组学先锋基因组学先锋J.CraigVenter、炎黄一号、炎黄一号第一个中第一个中国人基因组图谱先后完成国人基因组图谱先后完成2008，首张非洲人全基因组图谱问世首张非洲人全基因组图谱问世Pyrosequencing（焦磷酸测序焦磷酸测序,Biotage）454Sequencingabrandofsequencingby454LifeSciences,thatdramaticallyexpandspyrosequencingSequencingbyhybridizationNanoporesequencingPolonysequencing（聚合酶克隆聚合酶克隆）4.DNA序列测定技术的应用序列测定技术的应用生物基因组测序生物基因组测序:

人类人类30亿碱基对亿碱基对PCR产物分析产物分析限制性酶切位点分析限制性酶切位点分析蛋白质结构、功能预测蛋白质结构、功能预测二、DNA的化学合成的化学合成（DNAchemicalsynthesis）亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法（H.GobindKhorana）,35保保护5-OH碱基碱基氨基亚磷酸化合物活化氨基亚磷酸化合物活化3-OH亚磷酸三酯中间物亚磷酸三酯中间物磷酸三酯磷酸三酯第十节第十节基因和基因组基因和基因组一、基因与基因组的基本概念基因与基因组的基本概念1基因（基因（gene）经典生物学经典生物学:

基因是决定或影响生物体某一性基因是决定或影响生物体某一性状或某一表现型的染色体上的某一部分。

状或某一表现型的染色体上的某一部分。

分子水平的定义分子水平的定义（BeadleandTatum1940年年）:

基因是遗传物质上的一个片段，基因是遗传物质上的一个片段，“基因编码一基因编码一个酶个酶”或或“基因编码一个蛋白基因编码一个蛋白”基因的生物化学定义：

基因的生物化学定义：

基因是为各种多肽链或基因是为各种多肽链或RNA顺序编码的顺序编码的DNA片段。

为肽链和片段。

为肽链和RNA编编码的基因称为码的基因称为结构基因结构基因。

起调节基因转录和表。

起调节基因转录和表达作用的达作用的DNA序列称为序列称为调节顺序调节顺序，它们可以是，它们可以是结构基因的起始和终止信号，也可以是影响结结构基因的起始和终止信号，也可以是影响结构基因转录启动和开闭的顺序，或者作为构基因转录启动和开闭的顺序，或者作为DNA本身复制和重组的识别信号。

本身复制和重组的识别信号。

基因也可以称为基因也可以称为顺反子顺反子，一个顺反子就是一个，一个顺反子就是一个基因。

基因。

基因的大小基因的大小基因的大小可以直接估算，生物体中肽链基因的大小可以直接估算，生物体中肽链的平均长度约为的平均长度约为350个氨基酸残基，所以每个个氨基酸残基，所以每个基因平均有基因平均有1050个碱基对。

个碱基对。

基因组基因组（genome）一个细胞中，所有基因和基因间一个细胞中，所有基因和基因间DNA的总的总和称为基因组。

现在人们也把能独立传递遗传和称为基因组。

现在人们也把能独立传递遗传信息的病毒信息的病毒DNA，质粒，质粒DNA称为病毒基因组和称为病毒基因组和质粒基因组。

大肠杆菌基因组有质粒基因组。

大肠杆菌基因组有4,638,858bp；人类基因组人类基因组30亿亿bp。

二、天然二、天然DNA分子的大小与顺序特征分子的大小与顺序特征1.病毒病毒DNA分子分子病毒基因组可以由病毒基因组可以由RNA组成，也可以由组成，也可以由DNA组成组成,一般只含其中一种。

几乎所有植物病毒和一般只含其中一种。

几乎所有植物病毒和某些细菌病毒、动物病毒是某些细菌病毒、动物病毒是RNA病毒。

病毒。

RNA病毒基因组较小。

病毒基因组较小。

DNA病毒基因组分子量病毒基因组分子量变化较大（单链变化较大（单链/双链）。

双链）。

病毒病毒DNA在复制时可形成环状结构。

在复制时可形成环状结构。

bacteriophageT4ananimalvirus（adenovirus）aplantvirus基因组大约基因组大约9000核苷酸核苷酸一些细菌病毒的颗粒大小和一些细菌病毒的颗粒大小和DNA长度长度2.细菌染色体细菌染色体DNA和染色体外和染色体外DNA细菌染色体细菌染色体DNA：

只含一个环形染色体，所有基因只含一个环形染色体，所有基因几乎都是单拷贝。

几乎都是单拷贝。

E.coliDNA4.7106bp，周长，周长1.7mm，为大肠杆菌细胞长度的，为大肠杆菌细胞长度的850倍。

编码倍。

编码4300蛋白质基因和蛋白质基因和115稳定稳定RNA的基因。

的基因。

细菌质粒细菌质粒DNA：

细菌胞内，染色体外遗传因子，环细菌胞内，染色体外遗传因子，环状，分子量小，能在细菌细胞内独立复制；携带遗状，分子量小，能在细菌细胞内独立复制；携带遗传信息，赋予宿主遗传性状。

所带抗性基因可使寄传信息，赋予宿主遗传性状。

所带抗性基因可使寄主菌产生抗性。

现代基因克隆的主要载体。

主菌产生抗性。

现代基因克隆的主要载体。

质质粒粒可可以以作作为为载载体体将将外外源源基基因因引引入受体细胞。

入受体细胞。

3.真核细胞染色体真核细胞染色体DNA线形线形DNA分子。

分子。

人体细胞人体细胞DNA全长约全长约2m,一成人全部一成人全部DNA长长21014m,是地球周长的是地球周长的5106倍。

倍。

真核细胞真核细胞DNA含有重复顺序（高重复顺序、中含有重复顺序（高重复顺序、中等重复顺序）。

等重复顺序）。

人类染色体人类染色体真核生物细胞器中的真核生物细胞器中的DNA叶绿体和线立体叶绿体和线立体DNA是环形是环形DNA。

线立体线立体DNA小于小于20,000bp，为线立体，为线立体tRNA和和rRNA及少量线立体蛋白编码。

及少量线立体蛋白编码。

三、染色体三、染色体DNA的碱基顺序特征的碱基顺序特征细菌细菌单染色体单染色体几乎单拷贝（几乎单拷贝（copy）真核生物真核生物重复序列重复序列（repeatedsequence）p高度重复序列（高度重复序列（highlyrepeatedsequence）/卫卫星星DNA（satelliteDNA）：

）：

10bp，可重复百，可重复百万次万次，10%p中度重复序列（中度重复序列（moderatelyrepeatedsequence）：

）：

150-300bp，重复千余次，重复千余次，20%p单一序列（单一序列（uniquesequence）高度重复序列大多与着丝粒高度重复序列大多与着丝粒（centromere）和端粒（）和端粒（telomere）相关）相关着丝粒着丝粒细胞分裂细胞分裂端粒端粒染色体稳定染色体稳定间隔顺序间隔顺序外显子外显子（exon）、内含子、内含子（intron）和剪接（和剪接（splicing）u外显子：

外显子：

编码片段编码片段u内含子：

内含子：

非编码片段非编码片段u剪接：

剪接：

从初级转录物中，剪掉内含子，将相从初级转录物中，剪掉内含子，将相邻的外显子连接起来的过程。

邻的外显子连接起来的过程。

人血清白蛋白人血清白蛋白第十一节第十一节DNA超螺旋和染色超螺旋和染色质结构质结构拓扑学（拓扑学（topology）:

拓扑学用于研究一拓扑学用于研究一种物体在不断变形情况下的某些不变的性质。

种物体在不断变形情况下的某些不变的性质。

如：

一个闭合环形如：

一个闭合环形DNA分子在不切断分子在不切断DNA主链主链的情况下，不管这个的情况下，不管这个DNA分子怎样变形或弯曲，分子怎样变形或弯曲，它的拓扑学性质是不变的。

它的拓扑学性质是不变的。

一、一、DNA的拓扑学的拓扑学（topology）结构结构噬菌体噬菌体T2DNA长约长约50mE.coliDNA长约长约1mm人生殖细胞人生殖细胞