激光共聚焦显微镜样品制备_精品文档.pptx

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共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备DrLijunWuLeica/Shanghai23/6/20142022/11/13形态学分析免疫组织化学记录基因活动影响基因活动原位杂交多色FISH细胞追踪显微镜：

明场、相差、微分干涉、荧光图象荧光荧光检测的优缺点一、优点1、敏感2、专一3、快速4、容易5、简单6、应用范围广7、可靠二、缺点1、试剂贵2、仪器贵3、染色后样品不易保存，荧光淬灭荧光样品染色免疫荧光细胞化学法荧光探针荧光蛋白基因转染量子点法用于体内标记的荧光探针生物学中应用的荧光探针荧光团类型优点缺点自发荧光本身，天然无法控制，通常是令人讨厌的荧光染料明亮，光谱范围大，相对光稳定，大的行程移动，尺寸小，可以做成对环境敏感特异性标记细胞内蛋白质比较困难；抗体介导的标记；细胞通常要被固定荧光蛋白通过融合目标蛋白可以在活细胞内表达；可以作为结构破坏的靶；对一些环境参数敏感波长选择有限，低光稳定性，不是很亮，光谱交叉，相对庞大（5um）量子点（纳米晶体）更多很亮，光稳定，可调变光谱，宽激发光谱，窄发射光谱特异性细胞内标记比染料还难，庞大（10-15nm）定位（蛋白质，DNA，脂类）互相作用，空间结构改变细胞环境报道（pH,Ca+,酶活性）基因表达报道选择荧光探针光谱分离性毒性光稳定性光亮度细胞环境，成份和化学物质的荧光染料染色/区分活和死细胞细胞成份染料（线粒体，溶酶体，内质网和Golgi体）核酸染料（如：

DAPI,Hoechst,BO-PRO,POPO）离子敏感性染料（Ca2+,Mn2+,Zn2+,Na+,K+,Cl-）膜电位敏感染料（罗丹明123）荧光探针的使用1.荧光染料AlexaFluor系列荧光染料激发和发射光谱窄可用于多重荧光标记而更少光谱重叠ATTO系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性，已被应用于STED（StimulatedEmissionDepletion受激发射损耗）超高分辨率显微成像技术DyLight、CF等更多新型荧光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳定性、宽泛的PH稳定性等优越的特性而被广泛的应用于组织及细胞免疫荧光标记。

荧光染料Page13AttoandTracy（SigmaAldrich）AlexaFluor（Invitrogen）BODIPY（Invitrogen）Cy-dyesFluoProbes（Interchim）DyLightFluor（ThermoScientific,Pierce）DYandMegaStokesDyes（Dyomics）SulfoCydyes（CYANDYE,LLC）EmissionspectrafortheAlexaFluordyeseries（lifetechnology）孵育一抗孵育一抗漂洗漂洗孵育带探针的二抗孵育带探针的二抗再次漂洗再次漂洗图像图像非特异结合非特异结合免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色一抗选择一抗特异性高免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色AY1stantibodyY2ndantibodyAlexaFluorYEpitopeAColoroutsidethelinesDiADiICFPYFPDsRedGFPCGFPnewXFPvariants?

Alexa350Alexa488Alexa543Alexa568WhatevercomesnextDAPIHoechstFluoresceinOregongreenDiORhodamineTexasRedDiDMitoTrackerLysoTrackerAnti-CalnexinTubulinGM-130PhalloidinHoechst33258EEA1DAPIPIOrganellemarkersActinPIEREarlyEndosome共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备DrLijunWuLeica/Shanghai23/6/2014FluorescenceMicroscopyFluorochromesFluorochromeExcitationEmissionFiltersetNo.DAPI（DNA）3594611,2,25Hoechst33258（Bisbenzimid）3654801,2LuciferYellow4285405GFPgreen4715039,10,16,17CyanineCy24895059,24Alexa4884955059,24FITCFluoresceinisothiocyanat4905259,10,16,17,23-25TRITC,Rhodamin54058014,15,23-25Alexa54655657314,15,23-25DiIIndocarbocyanine540-560556-57514,15,0,26DiOCarbocyanine5505809,10,14,15,0CyanineCy357560515,20,24Texasred59562002.荧光蛋白AequoriaVictoria绿色荧光蛋白1962年,Shimomura等首次从多管水母属（Aequoreavictoria）中分离纯化出了GFP238个氨基酸,27-30kDa荧光基团由第65个至第67个氨基酸组成形成环状三肽20082008年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖荧光蛋白Page21R.Tsien2009NobellectureTheFPbeach荧光蛋白主要应用1.活细胞中的某种蛋白进行准确定位及动态观察2.可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。

3.GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程4.GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构5.蛋白之间相互作用（FRET）GFPTargetedSpecificallytoSubcellularCompartmentsA:

EGFP-fluorescenceinendosomesofVerocellsB:

ImmunostainingagainstendosomalmarkerEEA1,cy5-conjugatedsecondaryabS.Arnold10/2002转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：

MitoTrackerLysoTrackerAnti-CalnexinTubulinGM-130PhalloidinHoechst33258EEA1DAPIPIOrganellemarkersActinPIEREarlyEndosome绿色：

示CCL21（淋巴细胞区划因子）红色a：

示Perlecan（基底膜蛋白多糖）红色b：

示CollIV（IV型胶原）青色：

TRITC-dextr（TRITC-葡聚糖）小鼠耳部真皮层免疫荧光染色荧光细胞化学法：

1）吖啶橙荧光染色鉴别细胞的死活：

0.01%吖啶橙生理溶液，室温，5分钟。

Ex/Em：

480/530-640活细胞：

胞核黄黄绿色荧光（DNA），胞浆桔红色荧光（RNA）。

死细胞：

核荧光变红。

302）溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）：

与DNA结合，于细胞核产生荧光（红色）。

EB（10ug/ml）：

510/595，PI（10ug/ml）：

536/6233）DAPI和Hoechst33258，Hoechst33342:

与细胞核DNA结合，产生荧光。

DAPI:

350/470Hoechst33258:

360/505Hoechst33342:

340/450细胞骨架胞骨架F-actin（F-肌肌动蛋白）染色：

蛋白）染色：

用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽）罗丹明123染细胞线粒体（双氢罗丹明123：

10uM/ml）：

10ug/ml，室温，15分钟。

Ex/Em:

511/534（488/BP505-530）为膜电荷性染料，对活细胞，能特异与细胞中的线粒体膜结合，产生荧光。

反应线粒体功能。

死细胞无显色。

膜电位探针线粒体探针Mitotracker细胞荧光离子探针（11）游离钙离子含量测定：

）游离钙离子含量测定：

有Fura2AM,Indo1和和Fluo3AM,前两者激发波长为紫外，而且均是双激发波长的比率荧光，所以目前一般在荧光显微镜观察，特别是激光共聚焦显微镜观察中用Fluo3AM。

Ex/Em:

506/526。

Fluo3本身不发荧光，只有当与胞浆内游离钙离子结合后，受激发光照射才发出荧光。

Fluo3AM不能与游离钙离子结合，但它能穿过细胞膜进入细胞内（Fluo3不能透过细胞膜进入细胞），进入细胞后的Fluo3AM中的AM被细胞内非特异性酯酶水解，变为Fluo3，Fluo3与细胞内游离钙离子结合，发出荧光。

荧光强弱直接反应了细胞内钙离子的含量。

Fluo3AM染色：

Fluo3AM用DMSO配成贮存液，冰冻保存，使用时终浓度为1uM。

染色一般为37，3045分钟。

Fluo3染色细胞内钙离子，可以通过时间扫描，进行细胞内钙离子含量和分布的动态观察。

Fura-2D.J.Linden,PurkinjeneuronCalculationforFura-IndicatorsCa2+=Kd*Q*（R-Rmin）/（Rmax-R）-RrepresentsthefluorescenceintensityratioFlambda1/Flambda2inwhichlambda1（340nm）andlambda2（380nm）-QistheratioofFmintoFmaxatlambda2（380nm）-KdistheCa2+dissociationconstantoftheindicatorCalciumGreen-1

（2）细胞内pH的测定：

SNAFL：

双发射波长比率荧光。

Ex:

514（488）,Em:

580/640BCECF：

双激发波长比率荧光。

Ex:

490/440,Em:

530共聚焦样品的基本要求样品要有荧光或所要观测的结构可通过反射光或其它方式分辨比较好的保持原有的结构或特性（固定、活体培养）制备过程中不要引入干扰荧光或淬灭荧光的物质注意一下盛样品的容器及包埋介质共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备DrLijunWuLeica/Shanghai23/6/2014共聚焦前期流程免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色准准准准备样备样品品品品普通普通普通普通荧荧光光光光显显微微微微镜镜共聚焦共聚焦共聚焦共聚焦观观察察察察活细胞细胞爬片组织切片免疫细胞化学免疫组织化学判断结果好坏做好标记得到好的图像共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备DrLijunWuLeica/Shanghai23/6/2014共聚焦前期流程免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色免疫化学染色准准准准备样备样品品品品普通普通普通普通荧荧光光光光显显微微微微镜镜共聚焦共聚焦共聚焦共聚焦观观察察察察活细胞细胞爬片组织切片免疫细胞化学免疫组织化学判断结果好坏做好标记得到好的图像样品制备活细胞细胞爬片组织切片共聚焦专用普通培养系统1.材质：

塑料vs玻璃，透光率不同2.厚度：

0.17mm经荧光探针标记的活体细胞未经标记只看立体效果的细胞活细胞贴壁细胞悬浮细胞玻璃底培养皿粘附剂处理（多聚赖氨酸、刀豆素A等）*塑料皿只用低倍镜活细胞细胞爬片组织切片样品制备载玻片盖玻片1.载玻片和盖玻片均应平整、光洁，盖玻片厚度为0.17mm盖玻