RT-PCR反转录原理及方法_精品文档.ppt

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RT-PCR原理及方法09-10-15背景nn基因的表达基因组DNA（genomicDNA）信使RNA（messengerRNA,mRNA）蛋白质产物不同细胞或组织表达不同的基因不同细胞或组织表达不同的基因目的nn通过反转录（reversetranscription，RT）和聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。

原理及方法mRNA（messengerRNA）cDNA（complementaryDNA）PCR产物RT（反转录反转录）PCR（聚合酶链反应聚合酶链反应）原理及方法步骤1-提取总RNATRIzolTRIzol法抽提总法抽提总法抽提总法抽提总RNARNA1111、细胞、细胞、细胞、细胞1111101010107777或组织或组织或组织或组织100mg,100mg,100mg,100mg,加加加加1mlTRIzol1mlTRIzol1mlTRIzol1mlTRIzol（细胞用细胞用细胞用细胞用1ml1ml1ml1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EPEPEPEP管）管）管）管）颠倒混匀颠倒混匀颠倒混匀颠倒混匀10101010下，室温下，室温下，室温下，室温5555分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

2222、氯仿、氯仿、氯仿、氯仿1/51/51/51/5体积（体积（体积（体积（0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml），颠倒混匀），颠倒混匀），颠倒混匀），颠倒混匀10101010下，室温下，室温下，室温下，室温5555分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

3333、4444，离心，离心，离心，离心12000g12000g12000g12000g，15151515分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

4444、转上层水相（约、转上层水相（约、转上层水相（约、转上层水相（约400l400l400l400l）于另一）于另一）于另一）于另一1.5mlEP1.5mlEP1.5mlEP1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约管中，加等体积异丙醇（约管中，加等体积异丙醇（约管中，加等体积异丙醇（约400l400l400l400l），混匀），混匀），混匀），混匀室温室温室温室温10101010分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

5555、4444，离心，离心，离心，离心12000g12000g12000g12000g，10101010分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

6666、弃上清，加冰预冷的、弃上清，加冰预冷的、弃上清，加冰预冷的、弃上清，加冰预冷的75%75%75%75%乙醇（用乙醇（用乙醇（用乙醇（用DEPCDEPCDEPCDEPC水配）水配）水配）水配）1ml1ml1ml1ml。

7777、4444离心离心离心离心7500g7500g7500g7500g，5555分钟。

分钟。

分钟。

分钟。

8888、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥5-105-105-105-10分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于DEPCDEPCDEPCDEPC水中至水中至水中至水中至20l20l20l20l（可在（可在（可在（可在55-6055-6055-6055-60水中，水中，水中，水中，10101010分钟助溶）。

分钟助溶）。

分钟助溶）。

分钟助溶）。

9999、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总RNARNARNARNA浓度。

浓度。

浓度。

浓度。

步骤2反转录（RT）逆转录反应：

逆转录反应：

逆转录反应：

逆转录反应：

11、试剂、试剂、试剂、试剂浓度浓度浓度浓度体积体积体积体积终浓度终浓度终浓度终浓度RNA23l（11.5l）RNA23l（11.5l）Oligo（dT）150.05g/l4l（2l）0.005g/lOligo（dT）150.05g/l4l（2l）0.005g/l混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心，705min705min。

22、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心试剂试剂试剂试剂浓度浓度浓度浓度体积体积体积体积终浓度终浓度终浓度终浓度M-MLVBuffer58l（4l）1M-MLVBuffer58l（4l）1dNTPdNTP10mM2l（1l）0.5mM10mM2l（1l）0.5mMRNasinRNasin40U/l1l（0.5l）2040U/l1l（0.5l）20M-MLV200U/l2l（1l）200UM-MLV200U/l2l（1l）200U总体积总体积总体积总体积40l40l（20l20l）混匀，离心，）混匀，离心，）混匀，离心，）混匀，离心，4260-90min4260-90min。

33、9510min9510min（破坏（破坏（破坏（破坏MLVMLV），），），），44保存。

保存。

保存。

保存。

步骤3聚合酶链反应（PCR）nnPCRPCR反应：

反应：

反应体系：

总体积反应体系：

总体积20l（50l）20l（50l）试剂试剂浓度浓度体积体积终浓度终浓度TaqTaqBuffer10Buffer102l（5l_）12l（5l_）1dNTPdNTP10mM0.2l（0.5l）200uM10mM0.2l（0.5l）200uM上游引物上游引物10pmol/l0.3l（1l）10pmol10pmol/l0.3l（1l）10pmol下游引物下游引物10pmol/l0.3l（1l）10pmol10pmol/l0.3l（1l）10pmolcDNAcDNA模板模板（1-10l）（1-10l）TaqTaq酶酶2.5U/l0.3l（1l）2.5U/l2.5U/l0.3l（1l）2.5U/lDEPCDEPC水水20l-4.3l20l-4.3l混匀混匀反应条件：

反应条件：

955955分分预变性预变性94309430秒秒变性变性X40X40秒秒退火退火72307230秒秒延伸延伸727727分分终末延伸终末延伸28-3628-36循环，循环，44保温保温步骤4琼脂糖凝胶电泳nn加1-10lPCR产物与上样缓冲液（1-2.5l）混匀，加样，电泳。

所需材料及试剂nn一、实验器具与材料：

一、实验器具与材料：

11、移液枪：

、移液枪：

1ml1ml、200l200l、20l20l、10l10l、2l2l22、吸头：

、吸头：

1ml1ml、200l200l、20l20l33、匀浆管：

、匀浆管：

5ml5ml44、吸头台：

放置、吸头台：

放置1ml1ml吸头的一个，放置吸头的一个，放置20l20l吸头的一个吸头的一个55、EPEP管：

管：

1.5ml1.5ml、0.2ml0.2ml、100l100l66、试剂瓶：

、试剂瓶：

22个个60ml60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）的棕色试剂瓶（广口，带盖）11个个125ml125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）的白色试剂瓶（放无水乙醇）77、量筒：

、量筒：

50ml50ml、250ml250ml、500ml500ml88、容量瓶：

、容量瓶：

250ml250ml、500ml500ml、1000ml1000ml99、试管架：

、试管架：

5ml5ml、1.5ml1.5ml、20l20l1010、盐水瓶：

、盐水瓶：

250ml250ml、500ml500ml各各22个备用，一个装无水乙醇，另一个装个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPCDEPC水水1111、铝制饭盒：

、铝制饭盒：

44个个1212、塑料小饭盒：

、塑料小饭盒：

11个个1313、大瓷缸：

、大瓷缸：

22个个1414、锡泊纸：

一卷、锡泊纸：

一卷1515、卷纸：

、卷纸：

22卷卷1616、三角烧瓶：

带盖，稍大、三角烧瓶：

带盖，稍大所需材料及试剂nn二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备11、塑料制品：

（包括枪头、塑料制品：

（包括枪头、EPEP管、匀浆管等）管、匀浆管等）先将先将DEPCDEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入中，其中小枪头需要吸管打入DEPCDEPC水，过夜，然后高压，再水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次22、玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（、玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPCDEPC水泡）（洗净后先泡水泡）（洗净后先泡11DEPCDEPC过夜，再高压）过夜，再高压）33、匀浆器：

（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤、匀浆器：

（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤所需材料及试剂nn三、试剂配制：

三、试剂配制：

三、试剂配制：

三、试剂配制：

11、DEPCDEPC水：

吸出水：

吸出1ml1ml放在放在1000ml1000ml双蒸水中配成双蒸水中配成11DEPCDEPC水，水，放在放在1000ml1000ml容量瓶中静置容量瓶中静置44小时备用。

小时备用。

22、75%75%乙醇：

用无水乙醇乙醇：

用无水乙醇+DEPC+DEPC水配，然后放水配，然后放-20-20保存保存（其中（其中DEPCDEPC水需先高压）水需先高压）33、异丙醇：

放入棕色瓶中、异丙醇：

放入棕色瓶中44、氯仿：

放入棕色瓶中、氯仿：

放入棕色瓶中55、琼脂糖、琼脂糖所需材料及试剂四、几种缓冲液的配制：

四、几种缓冲液的配制：

四、几种缓冲液的配制：

四、几种缓冲液的配制：

11、电泳缓冲液：

、电泳缓冲液：

TrisTris54g54g硼酸硼酸27.5g27.5g0.5MEDTA20ml0.5MEDTA20ml？

pH8.0pH8.0蒸溜水蒸溜水1000ml1000ml55TBETBE（贮存液）（贮存液）再将再将55TBETBE稀释稀释1010倍成倍成0.5TBE0.5TBE就可以在电泳时使用（即工就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取作液浓度），如取50ml50ml贮存液贮存液+450ml+450ml水水-500ml-500ml工作缓工作缓冲液冲液22、上样缓冲液：

、上样缓冲液：

0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝0.25%0.25%二甲苯青二甲苯青FFFF30%30%甘油甘油66缓冲液，缓冲液，44保存保存所需材料及试剂nn五、琼脂糖凝胶的配制：

五、琼脂糖凝胶的配制：

五、琼脂糖凝胶的配制：

五、琼脂糖凝胶的配制：

11、1.0%1.0%：

1.0g1.0g琼脂糖琼脂糖+100ml+100ml电泳缓冲液，微波炉中火电泳缓冲液，微波炉中火3030秒秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至至沸腾，熔化的琼脂物冷却至6060时加入时加入10mg/ml10mg/ml溴化乙锭溴化乙锭（GoldenView）5l（GoldenView）5l，充分混匀，将温，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置置30-45min30-45min后进行电泳。

后进行电泳。

22、1.5%:

1.5%:

同上，将琼脂糖的量改为同上，将琼脂糖的量改为1.5g（1.5g（分辨率要求高时使分辨率要求高时使用用）所需材料及试剂nn六、需购置的六、需购置的六、需购置的六、需购置的RtRtRtRt-PCR-PCR-PC