微生物四项.doc
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微生物检测说明书
1菌落总数（CFU/mL）
使用仪器：
高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、培养箱、电炉、天平、冰箱、菌落计数器、pH计、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等
平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数，水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。
）
营养琼脂成分：
蛋白胨 10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂10g～20g、蒸馏水1000mL
制法：
将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经103.43kPa（121，15lb）灭菌20min，储存于冷暗处备用。
检验步骤：
（1）生活饮用水：
以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约l5mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数。
即为水样lmL中的菌落总数。
（2）水源水：
以无菌操作方法吸取lmL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:
10稀释液。
吸取l:
l0的稀释液1mL注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：
100稀释液。
按同法依次稀释成1：
1000，1：
10000稀释液筹备用。
如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。
用灭菌吸管取未稀释的水样和2个～3个适宜稀释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿内。
以下操作同生活饮用水的检验步骤。
菌落计数及报告方法：
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。
然后再求该稀释度的平均菌落数。
不同稀释度的选择及报告方法：
首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）。
若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）。
若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表1中实例3）。
若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表1中实例4）。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5）。
若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例6）。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。
若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。
如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6，再乘其稀释倍数作报告。
菌落计数的报告：
菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表1“报告方式”栏）。
表1稀释皮选择及菌落总数报告方式
实例
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落敬之比
菌落总数／（CFU/mL）
报告方式／（CFU/mL）
1:
10
1:
100
1:
1000
1
1365
164
20
—
16400
16000或1.6×
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8×
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
150
30
8
2
1500
1500或1.5×
5
多不可计
1650
513
513000
510000或5.1×
6
27
11
5
270
270或2.7×
7
多不可计
305
12
30500
31000或3.1×
2总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）
仪器：
培养箱、冰箱、天平、平皿（直径为9cm）、试管、分度吸管（lmL，10mL）、锥形瓶、抽滤设备、滤膜（孔径0.48um）、滤器、无齿镊子
总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。
品红亚硫酸钠培养基：
成分：
蛋白胨（10g ） ，酵母浸膏（5g） ，牛肉膏（5g） ，乳糖（10g） ，琼脂（15g～20g） ，磷酸氢二钾（3.5g），无水亚硫酸钠（5g），碱性品红乙醇溶液（50g/L）（20mL） ，蒸溜水（1000mL）
储备培养基的制备：
先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2～7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL～3mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。
平皿培养基的配制：
将上法制备的储备培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿内。
待冷却凝固后置冰箱内备用。
此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。
如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。
检验步骤：
准备工作：
滤膜灭菌：
将滤膜放人烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。
前两次煮沸后需更换水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。
滤器灭菌：
用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
也可用蒸汽灭菌器103.43kPa（121℃，15lb）高压灭菌20min。
过滤水样：
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×104Pa（负0.5大气压）下抽滤。
培养：
水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧。
两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h士2h。
结果观察与报告：
挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检：
紫红色、具有金属光泽的菌落；
深红色、不带或略带金属光泽的茵落；
淡红色、中心色较深的菌落。
按式计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL水样中的总大肠菌群数（CFU/100mL）报告之。
总大肠菌群菌落数（CFU/100mL）=
3耐热大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）
使用仪器：
隔水式恒温培养箱或恒温水浴、培养皿、冰箱、天平、滤器、滤膜（孔径0.48um）、抽滤设备、锥形瓶、分度吸管（lmL，10mL）、无齿镊子等
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。
耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，44.5℃培养24h能形成特征性菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法。
MFC培养基培养基成分:
胰胨（10g）,多胨（5g）,酵母浸膏（3g）,氯化钠（5g）,乳糖（12.5g） ,3号胆盐或混合胆盐（1.5g）,琼脂（15g）,苯胺蓝（0.2g）,蒸馏水（1000mL）
制法:
在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸（10g/L）的0.2mol/L氢氧化钠溶液10mL．混匀后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL蒸馏水中。
加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒人已溶解的琼脂，混匀调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
制好的培养基应存放于2℃～10℃，不超过96h。
本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL～3mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。
检验步骤：
准备工作同总大肠菌群。
过滤水样、培养：
水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入44.5℃隔水式培养箱内培养24h士2h。
如使用恒温水浴，则需用塑料平皿，将皿盖紧，或用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠封入塑料袋内，浸到44.5恒温水浴里，培养24h士2h。
耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。
结果报告：
计数被证实的耐热大肠菌落数，水中耐热大肠菌群数系以100mL水样中耐热大肠菌群菌落形成单位（CFU）表示，见式
耐热大肠菌菌落数（CFU/100mL）=
4大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）
使用仪器：
紫外光灯（6W、波长366nm的紫外灯，用于观测荧光反应）、滤器、滤膜（孔径0.48um）、抽滤设备、培养箱、天平、平皿（直径为9cm）、试管、分度吸管（lmL，10mL）、锥形瓶、金属接种环、冰箱、无齿镊子等
用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生-葡萄糖醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。
MUG营养琼脂培养甚成分，蛋白胨（5.0g），牛肉浸膏（3.0g），琼脂（15.0g） ，4-甲基伞形酮-D葡萄糖醛酸苷（MUG） （0.lg） ，蒸馏水（1000mL）
制法：
将干燥成分加入水中，充分混匀，加热溶解，103.43kPa（121℃，15lb）高压灭菌15min，最终pH为6.8±0.2。
在无菌操作条件下倾倒直径50mm平板备用。
倾倒好的平板在4条件下可保存两个星期。
本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL～3mL，于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。
检验步骤：
接种：
将总大肠菌群滤膜法有典型菌落生长的滤膜进行大肠埃希氏菌检测。
在无菌操作条件下将滤膜转移到NA-MUG平板上，细菌截留面朝上，进行培养。
培养：
将已接种的NA-MUG平板36℃±1℃培养4h。
结果观察与报告:
将培养后的NA-MUG平板在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果菌落边缘或茵落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。
记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告，报告格式同总大肠菌群滤膜法格式。
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