细菌真菌放线菌培养基配方.docx

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细菌真菌放线菌培养基配方

。

一．细菌培养基：

肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。

肉膏蛋白胨培养基

1.药品比例：

牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6

2.实验器材：

牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、lmol/LHCl、KNO

3、NaCl、K

2HPO

4·3H

2O、MgSO

4·7H

2O、FeSO

4·7H

2O、4.5mL无菌水6管，10%酚液，49.5mL无菌水（带玻璃珠）1瓶。

土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯。

电炉、高压蒸气灭菌锅、超净工作台.

3.配置方法

（1）称药品：

按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。

牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

（2）加热溶解：

在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至

所需量。

若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

（3）调pH：

检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。

若偏碱，则用lmol/LHCl进行调节。

pH的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

（4）过滤：

液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。

但是供一般使用的培养基，这步可省略。

（5）分装：

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：

固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（6）加棉塞：

试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。

棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。

有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。

有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

（7）包扎：

加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。

（8）灭菌：

将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。

（9）摆斜面：

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

（10）无菌检查：

将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

二.放线菌培养基:

高氏合成一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基,培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO

3作为氮源，K

2HP0

4、MgSO

4和FeS0

4作为无机盐等

高氏合成一号培养基

1.药品比例：

可溶性淀粉20g

NaCI0．5g

KNO

31g

K

2HPO

4．3H

2O0．5g

MgSO

4．7H

2O0．5g

FeSO

4．7H

2O0．01g

琼脂15～25g

水1000ml

pH7.4～7.6

2.实验器材：

试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器，PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布

3.配制方法：

（1）、称量和溶化

按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。

然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO

4．7H

2O可先配成高浓度的贮备

液，按比例换算后再加入。

待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。

（2）、调pH

用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。

反之，用1mol/LHCI进行调节。

（3）、分装和加塞

将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。

（4）、包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

（5）、灭菌

将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。

（6）、搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷却至500C左右，将试管口端搁在玻璃棒上。

斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长1/3。

（7）、无菌检查

将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。

三．真菌培养基：

马铃薯糖琼脂培养基（马丁氏培养基）

马铃薯糖琼脂培养基

1.药品比例

K

2HPO

41g，MgSO

4·7H

2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH

此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3．3ml。

临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0．3ml。

（孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的）

2.实验器材

KH2PO4，MgSO4•7H2O，蛋白胨，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素；

试管，三角烧瓶，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅

3.配制方法

（1）称量和溶解：

先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。

待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。

再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

（2）分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。

（3）链霉素的加入：

链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。

可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL，使每毫升培养基中合链霉素30μg。

四．灭菌

采用高压蒸气灭菌法进行灭菌，步骤如下：

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。

因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

五．土壤微生物的分离

1．取土壤：

取表层以下5～10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液（要无菌操作）

（1）制备土壤悬液：

称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底力最好），振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

（2）稀释：

用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。

注意：

操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每

次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

六．混菌法测定菌落数的方法

（1）细菌：

取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。

倒平板时要注意无菌操作。

（2）放线菌：

取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。

（3）真菌：

取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

在融化的马铃薯培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成真菌的平板。

4．培养：

将接种好的细菌、放线菌、真菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，真菌培养3～5d。

观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

七.

（一）平板制作及划线分离方法。

1．倒平板：

按无菌操作要求，在火焰旁操作。

2．划线分离：

使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。

3．培养：

方法同“土壤稀释分离”。

（二）斜面接种和穿刺接种

1．斜面接种

（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。

（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）。

注意划线要轻，不可把培养基划破。

（3）接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。

2．穿刺接种

（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。

（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。

（3）接种后30℃恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果。

八、注意事项

1．称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。

2．调pH时要小心操作，避免回调。

3．不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

4．一般土壤中，细菌最多，放线菌及真菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。

5．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。

6．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。

九．实验记录

l．记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。

2．检查培养基灭菌是否彻底，记录无菌检查结果

3．记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。

计算方法：

选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式：

总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数4．分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。