TAE缓冲液.docx

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TAE缓冲液

TAE缓冲液：

电泳缓冲液Tris-乙酸

TAE缓冲液成分及终浓度：

1、2mol/LTris碱

2、1mol/L乙酸

3、100mmol/LEDTA

4、水

配制1L的50×TAE缓冲液各成分用量：

1、Tris碱（242g）

2、冰乙酸（57.1ml）

3、EDTA【200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）】

4、水（补足1L）

50×TAE缓冲液的配制方法：

称下列试剂，1L烧杯

Tris                             242g

Na2EDTA.2H2O   37.2g

然后加入800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

加入57.1ml的醋酸，充分混匀。

加去离子水定容至1L，室温保存。

AE是使用最广泛的缓冲系统。

其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。

TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

loadingbuffer

loadingbuffer的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。

loadingbuffer的功能主要有两个。

第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。

SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。

细胞裂解后的裂解液，加loading100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。

6×loadingbuffer一般配置：

6×Loadingbuffer:

30mMEDTA

36%（v/v）Glycerol（甘油）

0.05%（w/v）XyleneCyanolFF（二甲苯青FF）

0.05%（w/v）BromophenolBLUE（溴酚蓝）

5×SDS-PAGELoadingBuffer配制方法

组份浓度：

250mMTris-HCl（pH6.8）

10％（W/V）SDS

0.5％（W/V）BPB

50％（V/V）甘油

5％（W/V）β-巯基乙醇

配制量：

5mL

配制方法：

1.量取下列试剂，置于10mL塑料离心管中。

1MTris-HCl1.25mL

SDS　0.5g

BPB　25mg

甘油2.5mL

2.加入去离子水溶解后定容至5mL。

3.小份（500μl/份）分装后，于室温保存。

4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。

5.加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右

1.生物学的聚合酶链式反应

定义

聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：

PolymeraseChainReaction），

聚合酶链式反应

具体内容点击：

 聚合酶链式反应，简称PCR。

聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

由美国科学家PE（PerkinElmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。

技术原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在

聚合酶链式反应

实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

工作原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时

聚合酶链式反应

间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul

PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）

工作步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

如图所示：

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

反应特点

特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

循环参数

1、预变性（Initialdenaturation）．

模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。

2、引物退火（Primerannealing）

退火温度一般需要凭实验（经验）决定。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

3、引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

延伸时间随扩增片段长短而定。

4、循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：

变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

5、循环数

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

PCR-PCR常见问题

电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。