1、TAE缓冲液TAE缓冲液:电泳缓冲液Tris-乙酸TAE缓冲液成分及终浓度:1、2mol/L Tris碱2、1mol/L 乙酸3、100 mmol/L EDTA4、水配制1L的50TAE缓冲液各成分用量:1、 Tris碱(242g)2、冰乙酸(57.1 ml)3、EDTA【200ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)】4、水(补足1L)50TAE缓冲液的配制方法:称下列试剂,1L烧杯Tris242gNa2EDTA.2H2O 37.2g然后加入800ml的去离子水,充分搅拌溶解。加入57.1ml的醋酸,充分混匀。加去离子水定容至1L,室温保存。AE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺
2、旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量(TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量),且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%,电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果,此外,回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小,长时间电泳(如过夜)不可选用,除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。loading bufferloading buffer 的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带,前面的蓝色的条带是溴酚蓝,代表的片段大小是 300bp,后面的有点绿色的条带是二甲苯青,代表的片段大小在4000bp左右。loadi
3、ng buffer的功能主要有两个。第一,里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于TAE,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性,因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液,加loading 100加热,也是为了中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解。6loading buffer 一般配置:6Loading buffer:30mM EDTA36%(v/v) Glycerol (甘油)0.05
4、%(w/v) Xylene Cyanol FF (二甲苯青FF)0.05%(w/v) Bromophenol BLUE (溴酚蓝)5SDS-PAGE Loading Buffer配制方法组份浓度:250mM Tris-HCl(pH6.8)10(W/V) SDS0.5(W/V) BPB50(V/V) 甘油5(W/V) -巯基乙醇配制量: 5mL配制方法:1.量取下列试剂,置于10mL塑料离心管中。1M Tris-HCl 1.25mLSDS0.5gBPB25mg甘油 2.5mL2.加入去离子水溶解后定容至5mL。3.小份(500l/份)分装后,于室温保存。4.使用前将25l的2-ME加到每小份中。
5、5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR(英文全称:Polymerase Chain Reaction),聚合酶链式反应具体内容点击:聚合酶链式反应,简称PCR。聚合酶链式反应,其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地
6、方聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE(Perkin Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双
7、链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。工作原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:模板DN
8、A的变性:模板DNA经加热至93左右一定时聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩
9、目的基因扩增放大几百万倍。反应体系与反应条件标准的PCR反应体系:10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)工作步骤标准的PCR过程分为三步:1.DNA变性(90-96):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA2.退火(25-65):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70-75):在Taq酶(在72左右最佳的活性)的作
10、用下,以dNTP为原料,从引物的5端3 端延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。如图所示:现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60-65间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为:引物与模板DNA特异正确的结合;碱基配对原则;Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温
11、性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一
12、般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。循环参数1、预变性(Initial denaturation)模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95加热3-5分钟。2、引物退火(Primer annealing)退火温度一般需要凭实验(经验)决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在72进行(Taq酶最适温度)。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95,30秒足以
13、使各种靶DNA序列完全变性:变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后,反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。PCR-PCR常见问题电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及, PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。
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