cDNA文库构建策略及其分析研究进展.docx

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cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

　　自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。

cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。

通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。

因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

　　从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以来，构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。

初期cDNA文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而YOUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。

近年来，cDNA文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。

本文就近年来发展的cDNA文库的构建及其类型特点作一简要综述。

1cDNA文库的构建

1.1cDNA文库构建的基本原理与方法

　　cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：

RNA的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定），要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。

由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。

在获得高质量的mRNA后，用反转录酶Oligo（dT）引导下合成cDNA第1链，cDNA第2链的合成（用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应），合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。

这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。

1.2cDNA全长文库

　　经典cDNA文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。

为了克隆到真正的cDNA全长，建立富含全长的cDNA文库具有重要意义。

为此，必须克服仅用mRNA的PolyA尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。

全长cDNA文库，是指从生物体内一套完整的mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体，是mRNA分子群的一个完整的拷贝。

全长cDNA文库不仅能提供完整的mRNA信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。

目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH公司的SMARTcDNALibraryConstructionKit方法或GeneRacer试剂盒（Invitrogen，USA）使用说明进行。

判断一个cDNA文库中的cDNA序列是否是全长基因的cDNA，主要方法有以下几种。

1.2.1直接从序列上评价

　　5'端：

如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因5'末端进行比较来判断。

如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个ATG上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5'帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是cDNA5'序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的cDNA的5'端是完整的。

3'端：

同样可以用其它生物已知的对应基因3'末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的PolyA加尾信号，或无明显加尾信号的则也有PolyA尾。

1.2.2用实验方法证实

　　可以通过引物延伸法确定5'端和3'端的长度，如：

5'端RACE，3'端RACE，或者通过NorthernBlot证实大小是否一致。

1.3对cDNA文库的分析

　　对cDNA文库质量的评价主要有两个方面。

第一方面为文库的代表性，cDNA文库的代表性是指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息（即mRNA种类）的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。

文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始cDNA文库中所包含的独立的重组子克隆数。

库容量取决于来源细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度mRNA是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。

满足最低要求的cDNA文库的库容量可以用Clack-Carbor公式N=Ln（1-P）/（1-1/n）计算（P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99％；N为文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数；T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数）。

第二方面是重组cDNA片段的序列完整性。

在细胞中表达出的各种mRNA片段的序列完整性。

在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5'端非翻译区，中间的编码区和3'端非翻译区。

非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。

因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。

2cDNA文库构建的其它类型

2.1均一化cDNA文库

　　它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。

WEISSMAN早就提出了可以通过基因组DNA饱和杂交的原理将cDNA文库进行均一化的理论。

但该理论一直以来都被认为不能应用于实际。

其主要限制因素是难以提供足量的极低表达丰度的cDNA用于饱和杂交，从而可能会造成部分基因的cDNA的丢失。

20年前，基于DNA-RNA杂交的研究就已经将基因的转录水平分为高中低3类。

随后研究进一步表明，绝大多数基因是处于中等或低等表达丰度的，在单个细胞中含有近1～15个拷贝，而高丰度表达基因的转录产物在单个细胞中最高可达5000个左右拷贝，约占总表达量的25％。

这种基因表达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的cDNA文库的障碍，其表达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。

对单一组织的cDNA文库而言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费，尤其是在大规模的EST测序中。

　　均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。

现在，在构建均一化的cDNA文库中至少有2种主要的观点：

一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火条件下复性的速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。

第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组DNA饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。

目前已报到的均一化cDNA文库多是根据第二种原理构建的，常用策略有基于PCR技术利用cDNA多次复性mRNA-cDNA杂交等。

有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达cDNA是处理前的0.3％～2.5％，基本满足节约筛选的要求。

　　均一化cDNA文库具有以下4方面的优点：

第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。

第二，增加克隆低丰度mRNA的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。

第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。

而以往的文库构建，忽略了mRNA丰度的影响。

第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。

2.2差减cDNA文库（SubtractivecDNAlibrary）

　　差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等）提取mRNA（或反转录后合成cDNA），在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子（Driver）与含有目的基因的试验方（Tester）进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。

消减杂交是构建差减cDNA文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。

差减杂交的方法主要有

（1）羟基磷灰石柱层析法（HAP）；

（2）生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；（3）限制性内切酶技术相结合的差减方法；（4）差减抑制杂交法（SSH）；（5）磁珠介导的差减法（MAST），其中SSH法最为常用。

　　抑制性消减杂交技术（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）是DIATCHENKO等人于1996年依据消减杂交和抑制PCR发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。

它主要是利用抑制PCR对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。

因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料（细胞或组织）高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。

近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。

2.3固相cDN