蛋白质分离纯化技术实验讲义剖析.docx
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蛋白质分离纯化技术实验讲义剖析
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）
一、实验目的
1、制作蛋白质浓度标准曲线；
2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理
Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：
灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：
仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、TritonX-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材
1、试剂：
1mg/ml牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。
2、器材：
滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。
四、实验方法
1、考马斯亮蓝G-250染料的配置
称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5ml无水乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，加MiliQ水定容至1L，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释
取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：
不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
4、标准曲线制作
以标准蛋白的量（mg）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。
由此标准曲线，求得趋势线以及公式（y=ax+b，其中y为吸光度值OD595，x为蛋白质的量，a和b为常量）并给出R2值，R2值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。
5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。
五、实验结果记录
OD595记录表
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
标准蛋白质（ml）
0
0.01
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
MiliQ（ml）
0.1
0.09
0.08
0.06
0.04
0.02
0
考马斯亮蓝G-250溶液（ml）
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
每管中蛋白质的量（mg）
0
0.01
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
光吸收值（OD595）
未知蛋白浓度（mg/ml）
标准曲线图
标准曲线：
R2值：
实验二、糖化酶酶活测定
一、实验目的
1、了解糖化酶酶活力单位的定义、测定原理；
2、掌握糖化酶酶活测定的方法。
二、实验原理
糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。
1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃，pH=4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g或U/ml表示。
三、试剂与器材
1、试剂
乙酸-乙酸钠缓冲液（0.05M，pH=4.6）;0.05M硫代硫酸钠标准溶液；0.1M碘溶液；200g/LNaOH溶液；0.1MNaOH溶液；2M硫酸溶液；20g/L可溶性淀粉溶液（现配）。
2、器材
恒温水浴锅；秒表；比色管；碘量瓶，滴定管。
四、实验方法
1、糖化酶反应阶段：
于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入25ml可溶性淀粉溶液（20g/L）及5ml乙酸-乙酸钠缓冲液（0.05M，pH=4.6），摇匀后于40℃水浴锅中预热5min。
在甲管中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下反应30min，两管中立即加入200g/L氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，终止反应，迅速取出冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml。
2、碘量法测定葡萄糖含量阶段：
吸取上述反应液与空白液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1M碘溶液10ml，再加入0.1M氢氧化钠溶液15ml，边加边摇匀，密塞，于暗处静置反应15min，取出，加2M硫酸溶液2ml。
3、滴定阶段：
上述反应液立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失呈无色，即为其终点。
注：
不同稀释倍数，应做相应的空白试验。
4、酶活力计算
40℃、pH4.6下，1小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。
X=（A-B）×c×90.05×32.2/5×1/2×n×2
=579.9×（A-B）×c×n（A-B）在3-6ml为宜
式中：
X----样品的酶活力，u/ml；
A----空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；
B----样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；
c----硫代硫酸钠标准溶液的浓度；
90.05----与1ml硫代硫酸钠标准溶液相当的葡萄糖的质量（以克表示）;
32.2----反应液的总体积，ml；
5----吸取反应液的体积，ml；
1/2----吸取酶液2ml，以1ml计；
n----酶稀释倍数；
2----反应30min，换算成1h的酶活力系数。
所得的结果表示至整数；平行试验相对误差不得超过2%。
五、实验结果记录
待测酶液的糖化酶酶活分析
稀释倍数n
滴定所用的硫代硫酸钠溶液的体积（ml）
A（乙管）
B1（甲管）
B2（甲管）
（A－B平均值）
样品的酶活力（U/ml）
实验三、绍兴黄酒麦曲中糖化酶的分离纯化
一、实验目的
1、熟悉蛋白质的分离纯化基本步骤，加深对相关知识的理解；
2、增强综合实验的设计、协调能力；
3、掌握蛋白质纯化各基本实验操作技能。
二、实验原理
离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基团在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交换作用。
虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。
因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。
同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐渐减少，因此可以全部被交换并吸附在树脂上。
如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，被洗脱的能力则取决于各自洗反应的平衡常数。
蛋白质的离子交换过程有两个阶段-------吸附和解吸附。
吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离而更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。
不同蛋白质与离子交换剂之间的形成电键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。
凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，其内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小组分的样品进入凝胶层析住后，各组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能够扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们的分子大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
三、试剂和器材
1、试剂
麦曲，，0.5%NaCl，硫酸铵，DEAE-纤维素，SephadexG-75，40mM磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）。
2、器材
烧杯，磁力搅拌器，转子，水浴锅，层析柱，橡皮管，夹子。
四、实验方法
1、粗酶液的制备
将麦曲样本以1:
3加入0.5%NaCl溶液中，于30℃浸提4h，滤纸过滤，滤液即为粗酶液G1，并量取初始粗酶液体积V1。
2、硫酸铵沉淀
粗酶液G1上清液中缓慢加入硫酸铵至10%饱和度，4℃静置1h，1,0000×g离心15min以除去部分杂质蛋白，收集上清。
上清液中继续缓慢加入硫酸铵至70%饱和度，4℃静置1h，1,0000×g离心15min，弃上清，收集沉淀。
向离心管中加入少量（约3ml）40mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，轻轻摇晃，使沉淀复溶，装入透析袋中，置于40mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，4℃透析搅拌过夜，以脱去酶液中的大量硫酸铵，期间更换两次透析液。
最终获得粗酶液G2，并量取体积V2。
附透析袋处理方法：
将透析袋于沸水中煮5min后用清水洗净，扎紧下口，检查不漏水后，将硫酸铵沉淀复溶后的粗分离酶液全部装入透析袋中，排除空气，扎紧上口。
注意：
透析袋要预留空间，因透析时酶液体积会变大。
3、DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化糖化酶
DEAE-纤维素的工作pH范围为pH2-9，采取增加离子强度的方式进行洗脱，由于无梯度混合器，因此采取直接更换洗脱液，氯化钠浓度从0M增加到1M，洗脱液体积为200ml。
（1）DEAE-纤维素的预处理
DEAE-纤维素以干态形式出售，使用前用蒸馏水充分溶胀，加热能加快其溶胀。
DEAE-纤维素在使用前的清洗：
先用0.5MNaOH浸泡半小时，除去碱液，用蒸馏水将交换剂洗至中性，再用0.5MHCl浸泡半小时，然后洗至中性，再用用0.5MNaOH浸泡半小时，最后洗至中性即可。
（2）装柱
用缓冲液将层析柱底部死空间内的空气排空。
预处理的离子交换剂放置在烧杯中，使得交换剂：
上清液（V/V）=2:
2，轻微搅拌混匀，利用玻璃棒引流，尽可能一次性将交换级倾入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下。
当需要往柱内补加交换剂时，应将沉降表面轻轻搅起，然后再次倾入，防止再次倾注时产生界面，再对装柱情况进行检查，利用透过光检查柱床是否规整，是否有气泡或界面存在。
（3）柱子的平衡
调整恒流泵速度为1.0ml/min（20.0rpm）,用40mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）平衡1.5-2个床体积（约120min），至基线平稳。
（4）加样：
目标蛋白的吸附量不应超过柱子有效交换容量的10-20%。
加样方法：
进样器或注射器。
加样量为3ml，手动加样。
具体操作方法如下：
旋开层析柱上口，用胶头滴管吸去床上层洗脱液至距床面0cm（液面相切），关闭柱出口，用胶头滴管吸取一定体积样品溶液贴内壁旋转缓缓加入，加样完毕后，打开柱出口，让样品缓缓渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面持平时，按同样方法小心加入几ml洗脱液冲洗内壁，并使缓冲液高出凝胶床3-5cm，旋紧层析柱上口，开启恒流泵进行洗脱。
（5）目标蛋白的吸附和杂蛋白的去除：
用1.5-2倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质（约120min），直至紫外记录曲线回到基线。
吸附时调整检测器的灵敏度为0.2A，电脑记录的满屏时间为120min，满屏量程为20mV。
注意：
长时间将蛋白质吸附在离子交换柱上再洗脱会造成洗脱困难，这是由于长时间的吸附引发蛋白质的构象缓慢改变，与交换剂结合更为牢固，并且这种构象变化一般都会造成蛋白质活性下降。
（6）目标蛋白的洗脱：
采用改变离子强度的方法，保持洗脱液pH不变，将氯化钠浓度从0mol/l直接增至0.5mol/l进行类似的梯度洗脱，洗脱液体积为200ml，做好出峰组分的收集（每3min收集一管），并根据酶活测定来判断目的组分。
洗脱时调整检测器的灵敏度为0.2A，电脑记录的满屏时间为120min，满屏量程为80-100mV。
酶活最高的收集管为G3，体积为V3。
（7）离子交换剂的清洗、再生和贮存：
继续洗脱至基线平稳后，换用起始缓冲液平衡3-4个床体积。
（实验结束后DEAE-纤维素的清洗/再生：
先用0.5mol/l的NaOH浸泡半小时，除去碱液，用蒸馏水将纤维素洗至中性，再用0.5mol/l的HCl浸泡半小时，然后洗至中性，再用0.5mol/l的NaOH浸泡半小时，最后洗至中性即可。
）
（8）酶活和蛋白质含量的测定：
测定几个出峰处所对应收集管的酶活和蛋白质含量，将酶活最高且出峰最高的收集管留样为，量取体积为V3。
4、SephadexG-75柱层析进一步纯化糖化酶
（1）凝胶的制备
称取SephadexG-75粉末适量，加2倍体积的双蒸水浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度1h，将溶胶悬浮，冷却至室温抽真空以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮颗粒，如有则反复倾倒去除，直至上清液不再混浊为止。
（2）装柱
取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入少量40mM磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0），然后将已溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，待凝胶沉积1-2cm后，打开出水口，使凝胶自然沉降。
用肉眼观察凝胶柱应没有纹路、均匀、无气泡。
如达不到要求，需重新装柱。
（3）平衡
调整恒流泵的流速为1.0ml/min，凝胶床用洗脱液（40mM磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液，pH6.0）平衡，约2个柱体积，需时约80min。
（4）加样
先吸去床面上层多余的平衡液，留约2-3mm，关闭柱出口，将样品粗酶液G3贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，流速为1.0ml/min，让样品渗入凝胶床内。
（5）洗脱
用平衡缓冲液进行层析，流速为1.0ml/min，并收集洗脱液，每3min收集一管。
洗脱时应调整检测器的灵敏度为0.2A，电脑记录的满屏时间为60min，满屏量程为20mV。
酶活最高的收集管即为纯酶液G4，量取其体积V4。
（6）柱的再生和保存
柱的清晰和再生采用洗脱液平衡即可。
保存：
凝胶洗脱后，脱水干燥，将干胶浸泡在50%乙醇脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度，至以95%脱水抽干，再经乙醚脱水，60℃烘干瓶装保存。
五、实验结果记录
1、纯化过程中各步的酶活分析记录
纯化步骤
各步体积（mL）
稀释倍数n
Na2S2O3溶液
A－B（mL）
酶活力（μ/mL）
总酶活（μ）
初始粗酶液G1
V1
透析酶液G2
V2
离子交换纯化G3
V3
凝胶过滤纯化G4
V4
2、纯化过程中各步的蛋白质含量分析记录
纯化步骤
稀释倍数n
OD595
蛋白质浓度（mg/mL）
蛋白质含量（mg）
初始粗酶液G1
透析酶液G2
离子交换纯化G3
凝胶过滤纯化G4
3、纯化过程中各步的蛋白质电泳图谱
4、根据所得结果计算填写下表（第二组）：
含量步骤
蛋白质含量（mg）
总酶活（U）
比酶活（U/mg）
回收率（%）
总纯化倍数
初始粗酶液G1
透析酶液G2
离子交换纯化G3
凝胶过滤纯化G4
实验四、SDS-PAGE电泳法测定蛋白质的分子量
一、实验目的
1、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理；
2、掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理
SDS-PAGE电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引入SDS（十二烷基磺酸钠）。
SDS能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。
强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负点的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然电荷差异。
由于SDS与蛋白质的结合是按照重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15kD-200kD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW=k-bX；式中MW为蛋白质分子量，X为相对迁移率，k与b为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
三、试剂和器材
1、试剂
低分子量标准蛋白Marker（97.4,66.2,43,31,20.1,14.4kD）;
30%丙烯酰胺；
10%SDS;
1.5MTris-HCl（pH8.8）；
1MTris-HCl（pH6.8）；
10%过硫酸铵（AP）（现用现配）；
TEMED（四甲基乙二胺）；
上样缓冲液（SDS100mg，巯基乙醇0.1ml，甘油2g，1.5MTris-HCl（pH8.8）600ul；定容至10ml）；
染色液（考马斯亮蓝R-2500.25g，冰醋酸50ml；乙醇200ml，定容至500ml，过滤后备用）；
脱色液（乙醇300ml，冰醋酸100ml，定容至1L）；
电泳缓冲液（Tris6g，甘氨酸28.8g，SDS1g,加水定容至1L）。
2、器材
垂直板电泳装置；直流稳压电源；10ul移液器。
四、实验方法
1、将玻璃板在灌胶支架上固定好。
2、配置分离胶（12%）
水
1.8ml
30%丙烯酰胺
2.4ml
1.5MTris-HCl（pH8.8）
1.5ml
10%SDS
60ul
10%AP
60ul
TEMED
4ul
将上述分离胶配好，用玻璃棒充分混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶面离玻璃凹槽2-3cm处停止，在胶面上轻轻加一层水，加水时顺着玻璃板缓慢加入，不能扰乱胶面。
待30min后胶凝聚，此时，在凝胶与水之间可以看到清晰的一条界面，倒出并用滤纸吸干胶面上的水（不能损坏胶面）。
3、制备浓缩胶（5%）
水
2.1ml
30%丙烯酰胺
0.5ml
1.0MTris-HCl（pH6.8）
0.38ml
10%SDS
30ul
10%AP
30ul
TEMED
2ul
将胶混合液充分混匀，注入玻璃板间隙，使胶面与玻璃板凹槽处平齐，而后插入上样梳，上样梳应一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。
待聚合20min凝聚后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破。
4、将凝胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液。
5、加样：
蛋白Marker上样3ul，未知样品上样10ul。
6、接通电源，注意正极对正极，负极对负极，进行电泳，开始电流恒定在10mA，进入分
离胶后改为20mA，溴酚蓝至凝胶边缘使停止电泳。
7、取出凝胶板，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后（marker端切一个角）放在大培养皿内，加入染色液，染色半小时以上。
8、将染色液回收，染色后的凝胶用水冲洗数次后，用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，再用水冲洗数次。
9、将凝胶小心放在一张白纸上，测量溴酚蓝及各蛋白质区带的迁移距离（各蛋白质区带中线至分离胶上缘的距离），记录于下表。
样品分子量（kD）
蛋白质迁移距离（cm）
溴酚蓝迁移距离（cm）
相对迁移率mr
97.4
66.2
43
31
20.1
14.4
？
迁移率=蛋白质迁移的距离/溴酚蓝迁移的距离
以各标准蛋白质样品的相对迁移率作横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标作图，得到标准曲线，根据未知蛋白的相对迁移率计算出其分子量。
注：
该标准曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定具有可靠性。
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