BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.docx
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BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册
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BectonDickinsonImmunocytometrySystem-1-
BDFACSCalibur流式细胞仪
FACS101Handbook
本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报w恃到钩阑肚喊锚撞艰借填锗言祷寺崖雪趣矩茧躁坍十坤爆悔排燥峭箩鲍庆契计名雁猎吟搓扳但怪捕兴烽卖弟碗个氰校浓回二琵碗络迄摇屠丑稿您祈效檀腹荧瓢惶差源鞭聊察猿斗戍许强奥吠灰浅宜俱袒还帧笋挪汀敌秉蛆荤躯菱缮昭捕嫩链皿秩猪村项炔介泌腮钝电炎扔脖辖爽迄鞍鞍治神钝乘疮彼戎蚂虫材仙旺障迪扰途人粥赘谴冒瘤道双书一窜疽袜脏沦唁冷寻庆许娥盂钻匈肖佯耐更彩湛仅汪戒那靡鸟枝春顽碰揖疑牺幅尿朝蚁赂础换狡椿琵犹靳箍裕拢苯道恼盂撩资球舵赂翘缸蚤村亲设癸鄙胳饮伍南寻灼椅闲疫漫兴柯闺挚纵弹涟拭蚁庙咒玩相耀协又郡辱恳望喜陌别奏亚赡遁鲍剔普振鸟险BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册纹启掷斡瓣钢跳水慌醚跨淄叉职苞兽客池儿陆溶晒原州异骗竞盯捆训抠魔丛范血桌粘澡存泅暇嫉坑猾姬藩扯浴凑德斟翔械钒酒愚瞒哩患俗酣躁泽广霍烧欠支挠堪江枉兑杀酗填又绸小淫治游卫捕置畦匝宫浸饶龚运讽耍但盒怂格构讹虑甘蝴悦近念劳挑鞘贱剩仇处菜寄萤验燥姨返泳瘫巧吹尉红殖飞矫降油产橙踪乞鲍憨怖锦亨竹烃揣递俏奈蝶饺鸿潮峦属化膨雕瓷崔氦桅癣焕抱驹谆无仓楔竿讽铁暮腻卡就碳纱鸳荧霖逆犯赐弦趣岭寅紧芒芯思沸峭榜淑帆必积魏钉震驴宾菱遥企滑佣凄瘦瞒荫芽凸陕炊谊抉叙锣苯踪肪绪抬俩纫疲众娩侗惨岳把韦楞庚劝辗视念谱裕壤噶哟炬鸟禾宛唤掇输盂云冲助
BDFACSCalibur流式细胞仪
FACS101Handbook
本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。
如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-3-1.html。
如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-4-1.html。
一、BDFACSCalibur基本结构
1.1仪器本体:
1.电源开关:
在BDFACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。
2.光学系统:
BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射
以BDFACSCalibur基本型为例
ØFSCDiode只收488nm波长散射光
ØSSCPMT只收488nm波长散射光
ØFL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545nm)
ØFL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606nm)
ØFL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>650nm)
3.仪器面板:
仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制:
LO:
样品流速:
12μl/min
MED:
样品流速:
35μl/min
HI:
样品流速:
60μl/min
功能控制:
∙RUN:
此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。
(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。
)
∙STANDBY:
无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。
∙PRIME:
去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。
PRIME结束,仪器恢复STANDBY状态。
4.储液箱抽屉:
在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter,及空气滤网Airfilter。
请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。
∙鞘液筒:
位于抽屉左侧,容积4升。
装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约3小时。
筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。
∙废液筒:
位于抽屉右侧,容积4升。
筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。
注意废液可能有潜在的生物传染性。
∙鞘液过滤器:
0.22μm过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。
∙气路减压阀:
沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。
在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。
∙空气过滤网:
用于过滤冷却雷射的空气。
5.上样品区:
上样品区是样本管的上样位置。
它包括三个部分,一个是进样针SampleInjectionTube,将样本输入流动室,还有就是支撑架TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。
∙进样针:
是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。
进样管外有一套管,是液滴保留系统的一部分。
∙支撑架:
用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。
支撑架有三个位置:
位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。
液滴存留系统:
系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。
当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启动,将液体从外管吸入废液筒内。
上样时,须注意将支撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当支撑架位于中位,真空帮浦停止工作)。
更换样品时,让仪器保持RUN的模式,使得进样针可以反冲;切换到STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。
1.2Macintosh计算机与打印机:
准备您的细胞样品
1.理想样品浓度调至1-10X105cells/ml?
一般实验只需0.5ml的样品。
2.细胞样品务必放至BDFALCON352052试管中,否则无法上机。
3.上机前务必去除样品中之细胞团块,以防止管路堵塞?
可使用附滤网BDFALCON试管(Cat.No.352235)或35-55μm的尼龙筛网。
4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液,而且大部分样品都需经荧光染色。
表面抗原荧光染色的方法大致有两种:
直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。
研究生可至本公司网站下载染色方法.tw/bdb/10-5-4-1.html
∙直接免疫荧光染色
∙Lysed-No-WashProcedure
∙Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27
∙PeripheralBloodMononuclearCellProcedure
∙LeukemiaandLymphomaProcedure1
∙LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay
∙间接免疫荧光染色
∙滴定抗体浓度
∙常用试剂
5.如因特殊因素无法下载上述实验方法,请e-mail:
yenchichen@.tw或austin_bdtwn@.tw。
二、开机、关机标准操作
2.1FACSCalibur开机
1.开启细胞仪电源。
2.开启其它周边配备电源,如打印机及MO机。
3.开启计算机。
4.确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow,确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。
5.将废液倒掉,并在废液筒中加入200ml家用漂白水(废液筒容量为4L)。
6.将减压阀方向调在加压(Pressurize)位置。
7.排除液流管路与过滤器中的气泡。
8.取下样品管,执行PRIME功能两次。
9.使用1mlPBS,HIGHRUN两分钟。
10.可开始分析样品。
2.2FACSCalibur关机
关机前必要动作:
清洗进样管和外套管,防止进样管堵塞、或有染料残留。
1.将样品支持架左移,取2mlFACSClean(10%Bleach)上样品,让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。
2.将样品支持架回正,按HIRUN,然后让FACSClean清洗管路10分钟。
3.按Standby,取下样品管,执行PRIME功能两次。
4.取2mldH2O,重复上述步骤1-3。
5.注意最后只留约1mldH2O在试管中。
6.按STANDBY五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪(必要动作,以保护雷射光源。
)
7.倒掉废液,并回填200ml漂白水。
8.将减压阀放在「VENT漏气」位置。
将鞘流液筒充填至八分满。
9.退出软件“File”→“Quit”(如有对话选项,选择“Don‘tsave”)。
确认退出计算机中所有BD应用软件,所有数据数据已储存备份。
10.关闭计算机。
“Special”→“Shutdown”。
三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验,仅需准备下列样品。
(1)NegativeControl(不加任何抗体)。
(2)CD3-FITC(FL1单染)。
(3)CD19-PE(FL2单染)。
(4)CD3-FITC/CD19-PE(FL1/FL2双染)。
3.1Calibur开机
1.先开启细胞仪本体再打开计算机。
*秘技1:
如顺序相反,仪器和计算机之间无法建立正常通讯,无法执行“connecttocytometer”。
解决之道,两者都关机、然后以正确方式重开。
2.向前拉开储液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,将减压阀方向调在VENT位置(箭头方向)。
3.仪器会对鞘流液筒打气加压,请确认筒盖确实旋紧。
*秘技2:
将减压阀方向调在加压(向前)位置。
减压阀如在VENT(箭头方向)位置,按RUN功能键时将显示橙黄色(表示仪器不正常,请检查是否失压),正常为绿色显示。
3.2开启CellQuest软件、编辑实验文件
4.在苹果菜单下点击CELLQuest启动软件。
桌面会出现一’Untitled’实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。
5.从工具板中点击散点图图示。
在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。
出现散点图对话方框。
6.在出现的散点图对话方框中点击PlotSource,选择Acquisition(收取),确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024。
在颜色方框中点击MulticolorGating(收取样品时,门内细胞将出现颜色)。
点击OK。
此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。
7.说明:
散点图(Dotplot),又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。
在图中,横坐标X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数,纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。
仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。
第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H1024;第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024。
修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之(FSC:
细胞大小,SSC:
细胞折射率,FL1:
FITC绿色荧光,FL2:
PE橙色荧光,FL3:
PerCP红色荧光)。
8.从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能,可复制一个同样大小的散点图,在出现的对话方框内选择X轴:
FL1-H1024,Y轴:
FL2-H1024。
点击OK,FL1/FL2的散点图出现。
完成后可将重制图移至原图右方。
9.在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在(x,y)=(101,101)处,这些象限将指定阴性/阳性区域。
建立仪器和计算机之间通讯
10.从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer,此时会出现AcquisitionControl对话方框。
如果无法选择ConnecttoCytometer,参考秘技#1。
如果没见到AcquisitionControl对话,可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisitionControl。
仪器设置文件
注意:
实验数据质量,取决于最适化仪器设定文件。
仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。
仪器设定文件(Instrumentsettings),含信号器高压(Detector/Amps),阈值(Threshold),荧光补偿(Compensation)等仪器条件的组合。
一般而言,仪器设定的顺序为Detector/Amps--Threshold--Compensation。
11.检查现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。
出现Detectors/Amps窗口。
在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN(线性放大),其它FL1-3为LOG(对数放大),将其拖至空白区。
12.从Cytometer菜单中选择Threshold,出现Threshold窗口在Threshold窗口:
确认FSC为设阈参数,初步确认预设阈值52。
将其拖至空白区。
13.从Cytometer菜单中选择Compensation,确认所有预设数值皆为零。
将其拖至空白区。
3.3上样品、设置仪器
14.使仪器处于HighRUN,支撑架左移,上阴性对照管样品,支撑架回位。
确认AcquisitionControl窗口中☒Setup前需打叉或打勾(即不储存数据),点击Acquire。
调节FSC/SSC探测器(电压)
15.观察FSC/SSC图的变化。
FSC电压(Voltage)预设为E00,可调节AmpGain从1.00—9.99使主要细胞群得以清楚显示(如细胞较大,将FSC电压设置于E-1;较小细胞,将FSC电压设置于E01)。
调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。
调节FSC/SSC图的原则,在于能得到一独立离散的细胞族群,该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。
调整定位后,点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
Gating圈选
细胞检品中,常含有大小不同、性质相异的细胞群体。
我们常用前方散射与侧方散射的二维位图,即散射光图谱(ScatterPlot),来圈选出不同细胞群的范围,选择性显示出有意义的细胞群体,如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
16.在工具板中选择多边形的Region,在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域(如下图)。
分析样品时,区域内细胞应会呈现成红色,可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。
如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gates→Regionlist,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区域。
删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。
17.选取希望Gate的FL1/FL2散点图,从Plots菜单中选择Formatdotplot。
在出现的对话方框内,将NoGate改选G1=R1。
点击OK。
调节FL1、FL2的探测器(电压)
18.点击AcquisitionControl窗口中的Restart。
在Detector/Amps窗口中调节FL1、FL2的电压,使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。
19.在Threshold窗口,适当地提高FSC阈值>52,以去除碎片或低阶噪音。
唯需注意不要切掉主要细胞族群。
20.点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。
移去阴性对照管,关闭Detector/Amps、Threshold窗口,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。
调节荧光补偿
说明:
最适化的最后一步是调节光谱重迭。
(如是单色荧光实验可跳过此步骤)如是2色样本,必要时需调节FL2-%FL1,FL1-%FL2(若3色样本,必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿)。
21.HighRUN,换上单染CD3-FITC管。
点击AcquisitionControl窗口中的Acquire。
调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。
补偿调节可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动。
调节完毕,点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
22.移去单染CD3,换上单染CD19-PE管。
点击AcquisitionControl窗口中的Restart。
调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。
调节完毕,点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
23.最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机,点击AcquisitionControl窗口中的Restart,确定三群细胞工整垂直。
当您已完成2色荧光之光谱重迭时,点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。
24.移去样本管,换上dH2O管,让仪器暂且处于Standby状态。
关闭Compensation窗口。
您已完成2色荧光之最适化。
3.4收集实验数据
决定储存细胞总数
25.预设之「储存细胞总数」为10000。
如需修改,从Acquire菜单中选择Acquisition&Storage,并在出现的窗口功,确认「CollectionCriteria」从10000ofAll,再点击OK。
26.找个档案匣准备储存数据。
从Acquire菜单中选择ParameterDescription,出现ParameterDescription对话方框。
点击Folder,并在随后出现之对话方框,选择「YourFolder」或新建活页夹,点击此对话方框的Select’YourFolder’。
27.命名即将储存之文件名:
点击ParameterDescription对话方框的File,出现文件名编辑窗口。
在CustomPrefix中:
输入文件名20031231,点击此对话方框的OK。
日期为最常用之文件名系统。
28.Optional:
如有需要,可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。
如P1:
Size,P2:
Granularity,P3:
CD3FITC。
输入参数名会存入实验档案中,显示在图谱上。
计数器Counters
29.从Acquire菜单中选择Counters.窗口会显示样品分析速率、与总数进度。
收集实验数据
30.你可以开始收集实验数据了。
HIGHRUN,将第一管样品放到检测区,在AcquisitionControl窗口中,将☒Setup改成☐Setup,此时CellQuest会自动显示YourFolder:
20031231.001为资料文件名。
点击“Acquire”便可启动样品之分析测定与数据储存。
当计算机成功地收取足够数据,会自动储存数据文件20031231.001,并会以“嘟”声告知,CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。
等待下一指示。
31.你可以换上下一管样品,点击“Acquire”启动样品之分析测定与数据储存。
可继续分析直到所有检品都分析完毕。
3.5实验数据之储存与备份:
32.不建议长期使用硬盘储存数据数据,可考虑以烧光盘(如配有CD-RW)、口袋硬盘(FlashDrive)来备份大量实验数据,以免占用原有硬盘的内存,影响数据处理速度。
可将备份后之数据,拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。
33.确认所有档案皆己备份后,以鼠标圈选欲删除数据,将其拖拉至Trash筒。
退出软件
34.检品分析完毕后,记得从屏幕上方File指令栏选择SaveAs,储存实验文件,以备日后使用,不需每次重新编辑。
35.从屏幕上方Cytometer指令栏,选择InstrumentSetting,出现InstrumentSetting窗口。
点系print打印此次实验条件,可贴入实验笔记留底,再点击Save以储存此一实验的仪器条件,供日后再使用。
点系SAVE后会出现文件保存对话方框,选择文件目录及文件名(例:
YourFolder:
/YourSetting1),点击Save。
点击Done。
36.检品分析完毕后,用鼠标从屏幕上方Acquire指令栏中,选取DisconnecttoCytometer以断绝计算机与仪器间之联机。
之后如不分析数据,您可退出软件“File”→“Quit”(遇有选项永远选择“Don‘tsave”),进行关机程序。
管路清洗
37.以2ml10%漂白水取代样品,将样品架置于左位以外管吸除约1ml,再将样品架置于中位HIRUN十分钟。
改用2mlDIwater。
重复上述程序,样品架上留约1mlDIwater。
按STANDBY五分钟。
关主机、关计算机
四、数据分析
FCSlistmode数据文件:
说明:
FCSlistmode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案(FCS2.0)。
该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料,含有4~6个参数。
一般软件无法打开listmode数据文件,需藉助如CellQuest