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外泌体之家笔记

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外泌体简介

Exosome，中文名外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。

尽管外泌体最初在1983年就被发现，但人们一直认为它只是一种细胞的废弃物。

然而最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。

这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。

最近的研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。

不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。

外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好靶向给药系统（targeteddeliverysystem）。

2015年，随着精准医学概念的提出，越来越多的人开始关注如何能做到疾病的精确诊断和治疗。

外泌体作为一个新型的研究热点，由于它在体内存在的广泛性和获取的便捷性，已经成为了疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医学发展上有着光明的前景。

综述

Cell：

外泌体的研究现状与未来方向--CQ

虽然，已有初步研究结果解释外泌体在体内的运输途径。

但关于，其介导的细胞间的信号传导的功能研究仍需要一些实质性的研究来解释。

在这篇综述中，作者以肿瘤细胞及其微环境为背景，认为癌细胞分泌的外泌体对癌症的发生及恶化起着重要的媒介调控作用。

在这篇Cell文章中，作者首先总结了目前外泌体最引人注目的功能研究：

1）外泌体携带的蛋白促进了肿瘤进展和转移；2）外泌体的分泌、运输途径等传递信号通路；3）外泌体中的小RNA具有什么作用；4）外泌体对肿瘤免疫的影响，以及对肿瘤抗放疗、抗化疗的影响。

然后还介绍了对外泌体的功能了解存在着哪些局限，比如说，外泌体存在着众多子类，怎么从物理、生化上区分开，比如说不同类型的外泌体存在哪些不同的生物标志物，已及从生理学功能上区分不同类型的外泌体仍存在很多难题。

肿瘤

免疫

干细胞

心血管

诊断

靶向给药

方法组学

分泌机制

方法及组学

Nanoscale：

一种能高纯度捕获和释放外泌体的微流体装置

目前，最好的分离外泌体的金标准方法仍然是超速离心法，通常得率较低（5％至25％）。

其它方法，如基于聚合物的分离试剂盒，会非特异性地沉淀下所有外泌体大小的物质，需要额外步骤去除杂质，且价格昂贵。

研究人员设计了一种微流体装置，用于捕获血液中的外泌体。

该装置含有两个不同的免疫模块层，通过抗体与外泌体结合实现高通量特异性分离，并且能够通过机械旋转来增强抗体和外泌体之间结合的机会。

此外，还会对分离下来的外泌进行去抗体处理，使外泌体恢复原状，有利于下游的分析。

研究人员使用MCF-7分泌的外泌体验证了本装置的性能，发现分离出来的浓度和比例均高于常规试剂盒。

这种简单快速的外泌体捕获技术对阐明癌症患者外泌体的功能具有很大的潜力，因此可以应用于各种基于外泌体的癌症研究。

参考文献:

KangYT,KimYJ,BuJ,ChoYH,HanSW,MoonBI.High-puritycaptureandreleaseofcirculatingexosomesusinganexosome-specificdual-patternedimmunofiltration（ExoDIF）device.Nanoscale.2017Sep1.

肿瘤

促进增殖

促进转移

免疫逃逸或免疫杀伤

【综述】外泌体及miRNA在肿瘤耐药中的作用

在化疗过程中，癌细胞能产生耐药性，主要是通过降低细胞膜的药物通透性和增强细胞对药物的外排作用实现的。

癌细胞能通过外泌体的形式向外排出化疗药物而使化疗药物失效。

外泌体miRNA如何在肿瘤微环境中“帮助”肿瘤产生耐药性，尚未得到充分的研究和阐述。

在这篇综述里，研究人员着重介绍关于外泌体介导的miRNA递送在调控耐药性方面的研究。

研究人员还认为外泌体可作为对抗耐药性的新方法。

BachDH,HongJY,ParkHJ,LeeSK.TheroleofexosomesandmiRNAsindrug-resistanceofcancercells.IntJCancer.2017Jul15;141

（2）:

220-230.

NK细胞外泌体的抗肿瘤作用

来自韩国庆北国立大学医学院的Byeong-CheolAhn研究组发现NK细胞外泌体对黑色素瘤细胞具有细胞毒作用。

值得进一步将其发展为癌症的潜在免疫治疗策略。

该研究发现，NK细胞外泌体对黑色素瘤细胞具有细胞毒性，但是对正常细胞无影响。

通过FasL抑制剂可减轻其对黑色素瘤细胞的细胞毒性。

NK细胞外泌体在体外诱导了黑色素瘤细胞的凋亡。

接着，研究人员利用小鼠模型在体内检测了NK细胞外泌体的肿瘤抑制作用，发现NK细胞外泌体处理组的肿瘤大小显著小于对照组。

是来自南加利福尼亚大学的研究人员，介绍了活化的人NK细胞的胞外囊泡的大规模分离及其细胞毒性作用。

使用聚合物沉淀结合密度梯度离心的方法分离EV。

1. Zhu,L.,etal.（2017）."ExosomesDerivedFromNaturalKillerCellsExertTherapeuticEffectinMelanoma."Theranostics7（10）:

2732-2745.

2. Jong,A.Y.,etal.（2017）."Large-scaleisolationandcytotoxicityofextracellularvesiclesderivedfromactivatedhumannaturalkillercells."JExtracellVesicles6

（1）:

1294368.

MD安德森癌症中心发文：

胶质瘤相关MSC分泌的外泌体增强胶质瘤干细胞的致癌性

研究表明，癌细胞分泌外泌体中的原癌miRNA的转移可以改变非癌细胞的生物学特性，而肿瘤抑制性miRNA的转移可以抑制肿瘤生长。

在此前一项研究中，胶质瘤细胞分泌含有mRNA和miRNA的外泌体，促进血管形成。

胶质瘤的细胞外囊泡将miR-1递送至受体细胞，改变了胶质瘤细胞侵袭和增殖特性并且影响基质细胞促进内皮细管的形成。

另有研究认为，GBM衍生的外泌体可将miRNA转移至小神经胶质细胞中。

来自MD安德森癌症中心FrederickLang研究团队的研究人员认为神经胶质瘤相关的人类间充质干细胞（GA-hMSC）————胶质母细胞瘤的基质成分，能够释放外泌体，增加肿瘤起始胶质瘤干细胞（GSCs）的增殖和克隆形成。

研究人员分析了外泌体内容物，鉴定出miR-1587是GSCs外泌体的作用介质，其中部分机理是可下调肿瘤抑制性核受体共抑制因子NCOR1。

【Cell】肿瘤细胞迫使基质细胞通过外泌体释放无蛋白结合的RNARN7SL1促进肿瘤的生长和转移

乳腺癌细胞触发基质细胞NOTCH-MYC信号通路导致POL3驱动的RN7SL1增加。

在外泌体转移到免疫细胞后，非屏蔽的RN7SL1触发炎症反应；转移到乳腺癌细胞后，非屏蔽RN7SL1激活PRRRIG-1以增强肿瘤生长、转移和治疗抗性。

Highlights

胞质RNA被RNA结合蛋白屏蔽从而抑制RIG-I的识别

肿瘤成纤维细胞中NOTCH-MYC信号通路促进非屏蔽的RN7SL1RNA通过外泌体释放

外泌体中的非屏蔽RN7SL1作为DAMP激活乳腺癌的RIG-I

RNA的非屏蔽与基质激活协同促进炎症和肿瘤进展

NabetBY,QiuY,ShabasonJE,etal.ExosomeRNAUnshieldingCouplesStromalActivationtoPatternRecognitionReceptorSignalinginCancer[J].Cell,2017,170

（2）:

352-366.e13.

MateiI,KimHS,LydenD.UnshieldingExosomalRNAUnleashesTumorGrowthAndMetastasis[J].Cell,2017,170

（2）:

223-225.

Nature：

脑微环境通过外泌体microRNAs促进肿瘤转移---CQ

相同来源的肿瘤细胞转移到不同的器官后会显示出不同的基因表达谱。

显然，转移的肿瘤细胞和外在信号之间在转移器官的动态相互作用影响其转移后的生长。

这篇研究文章揭示了正常表达PTEN（一种重要的肿瘤抑制因子）的人和小鼠的肿瘤细胞在传播到脑部后丢失PTEN的表达，但是传播到其他器官后不会。

在转移到脑后丢失PTEN的肿瘤细胞在离开脑部微环境后PTEN的表达水平会得到恢复。

这种脑微环境依赖的、可逆的PTENmRNA和蛋白下调是有脑部星型胶质细胞来源的microRNAs调控的。

星型胶质细胞来源的exosome介导了与转移肿瘤细胞之间的靶向PTEN的microRNAs的传递。

体内实验证明，星型胶质细胞特异性敲除靶向PTEN的microRNAs或者阻断星型胶质细胞分泌exosome可恢复PTEN并抑制脑部的转移。

此外，这种适应性脑转移肿瘤细胞的PTEN丢失导致趋化因子CCL2分泌的增加，招募表达IBA1表达的骨髓来源的细胞，从而通过增加繁殖和抑制凋亡来相互促进脑转移肿瘤细胞的生长。

Nature：

外泌体整合素分子决定了肿瘤转移的器官倾向性--CQ

研究表明被特定器官的细胞获取的肿瘤外泌体可为肿瘤的转移准备转移前微环境。

用肺转倾向的肿瘤细胞来源的外泌体处理小鼠后可是骨转倾向的肿瘤细胞重新定向。

外泌体的蛋白质组学分析发现不同器官倾向性的肿瘤细胞来源的外泌体具有不同的整合素（integrin）表达谱，整合素α6β4和α6β1与肺转有关，而整合素αvβ5与肝转有关。

Knockdown整合素α6β4和αvβ5可减少外泌体被靶器官细胞获取，进而分别降低了肺和肝的转移。

进一步研究发现外泌体整合素被细胞获取后激活了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表达。

最后通过临床数据分析显示外泌体整合素和作为预测肿瘤转移的器官倾向性的诊断指标。

外泌体让癌中之王露出蛛丝马迹--CQ

来自美国M.D.AndersonCancerCenter研究者们通过大量的胰腺癌病人血清样本分析发现，相较正常人而言，胰腺癌病人血清中GPC1（glypican-1）阳性的exosome占比显著增高。

进一步研究发现，GPC1阳性exosome在早期胰腺癌病人的血清中丰度就显著高于正常人群，这一发现为胰腺癌的前期诊断提供了十分重要的依据，为胰腺癌病人带来了福音，也可能会对胰腺癌的诊断带来颠覆性的改变。

Nature：

Glypican-1identifiescancerexosomesanddetectsearlypancreaticcancer. 

胰腺癌诊断标志物，外泌体miRNA要优于GPC-1

CP容易可能被误诊为PDAC从而导致患者不必要的胰腺切除。

因此，早期PDAC诊断和PDAC和CP之间的明确鉴别是至关重要的。

研究人员比较正常对照志愿者和PDAC和CP患者的外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（exosomalGPC-1）和miRNA水平。

研究人员发现GPC-1并不是PDAC的诊断标志物，而PDAC患者的外泌体microRNA-10b（miR-10b）、miR-21、miR-30c和miR-181a的高表达和miR-let7a的低表达可以容易地将PDAC与正常人和CP患者分开。

与GPC1相比，在PDAC患者进行胰腺切除后24小时内，升高的外泌体miRNA水平会降低至正常值。

所有29例PDAC病例均显示出显着升高的外泌体miR-10b和miR-30c水平，但是其中有8例却具有正常或略微增加的CA19-9水平。

因此，研究人员认为外泌体miRNA作为PDAC标志物的诊断方式要优于外泌体GPC1或血浆CA19-9水平，并发现了PDAC和CP的诊断差异。

参考文献：

LaiX,WangM,McElyeaSD,ShermanS,HouseM,KorcM.AmicroRNAsignatureincirculatingexosomesissuperiortoexosomalglypican-1levelsfordiagnosingpancreaticcancer.CancerLett.2017May1;393:

86-93.

Cell：

exosome从基质细胞转移到乳腺癌细胞调节其治疗的耐受性--CQ

来自宾夕法尼亚大学的研究人员在Cell上发表了关于exosome从基质细胞转移到乳腺癌细胞从而调节其治疗的耐受性通路的最新研究成果。

该研究发现，基质细胞和乳腺癌细胞利用旁分泌（paracrine）和近分泌（juxtacrine）信号来启动化疗和放疗的耐受性。

在这中复杂的相互作用中，exosome从基质细胞转移到乳腺癌细胞。

Exosome中的RNA成分，大部分是非编码转录本和可转移元件，促进RIG-I受体的识别，从而激活STAT1依赖的抗病毒信号通路。

与此同时，基质细胞也能激活乳腺癌细胞的NOTCH3。

这种旁分泌的抗病毒作用和近分泌NOTCH3信号通路在STAT1汇合从而促进NOTCH3的转录反应和治疗耐受的肿瘤起始细胞的繁殖。

这种作用能被gamma分泌酶抑制剂废除。

因此，基质细胞利用exosome来介导抗病毒信号参与了一个错综复杂的与乳腺癌细胞的相互作用。

这能够使乳腺癌耐受治疗并重新起始肿瘤的生长。

Nature子刊】天津医科大学肿瘤医院巴一教授、应国光教授：

外泌体传递EGFR调节肝脏微环境促进胃癌肝转移

自“种子与土壤”假说以来，转移的器官倾向性一直是癌症最大的奥秘之一。

尽管EGFR在癌细胞中的作用得到了很好的研究，但由外泌体转运的分泌的EGFR的作用的研究较少。

来自天津医科大学肿瘤医院的巴一教授、应国光教授在最新的NatureCommunications杂志上报道了EGFR在胃癌细胞分泌的外泌体可以被递送到肝脏并且整合在肝脏基质细胞的质膜上。

通过抑制miR-26a/b表达，证实易位的EGFR能有效激活肝细胞生长因子（HGF）。

此外，结合迁移的癌细胞上的c-MET受体的上调的旁分泌HGF为“种子”提供了肥沃的“土壤”，促进转移性癌细胞的着陆和增殖。

因此，该研究提出衍生自癌细胞的含有EGFR的外泌体有利于促进肝脏特异性转移的肝样微环境的发展。

Exosome-deliveredEGFRregulateslivermicroenvironmenttopromotegastriccancerlivermetastasis.NatCommun.2017Apr10;8:

15016.doi:

10.1038/ncomms15016.IF=11.329

NatureCommunications：

衰老细胞分泌小囊泡促进癌细胞增殖

免疫

【重磅】Nature：

下丘脑干细胞分泌外泌体延缓衰老

在2013年，蔡教授的研究团队曾已在Nature杂志上发表过一篇题为“HypothalamicProgrammingofSystemicAgingInvolvingIKKβ/NF-κBandGnRH”，认为下丘脑具有引起全身衰老的程序性作用。

下丘脑对于小鼠全身衰老的发展至关重要，其机理包括由IκB激酶-β（IKK-β）、核因子κB（NF-κB）和相关小胶质细胞介导的下丘脑免疫神经元免疫间的相互作用。

通过阻止衰老相关的下丘脑或脑IKK-β和NF-κB的激活，能够在小鼠中实现延迟衰老进程并延长寿命。

IKK-β和NF-κB抑制促性腺激素释放激素（GnRH）使衰老相关的下丘脑GnRH下降，GnRH的治疗可以改善神经发生并减缓衰老。

总之，下丘脑通过免疫神经内分泌间的相互作用，在衰老发生中具有程序性作用。

在本研究中，蔡教授的研究团队设计了几种小鼠模型，他们将共表达有Sox2和Bmi1两个基因的下丘脑神经干细胞/祖细胞（htNSCs）消融杀死，他们发现，随着这些下丘脑干细胞的消失，小鼠开始出现衰老症状。

每个小鼠模型都表现出来了衰老相关的生理变化或者寿命的缩短。

相反，中年小鼠中植入经过改造的健康的下丘脑干细胞/祖细胞后，小鼠的衰老症状延迟并且寿命延长，并且这些经改造后的下丘脑干细胞可以在衰老相关的下丘脑炎症微环境下存活。

在机制上，下丘脑干细胞/祖细胞会将外泌体微小RNA（miRNA）分泌到脑脊液中，而这些外泌体miRNA在衰老过程中会下调，而用健康的下丘脑干细胞/祖细胞分泌的外泌体的治疗便能够减慢衰老进程。

综上所述，机体衰老的速度基本上是由下丘脑干细胞所控制的，而该过程一部分是下丘脑干细胞通过释放外泌体miRNA的来实现的。

靶向给药

【Nature新闻综述推荐】利用外泌体靶向KRAS治疗胰腺癌

KRAS的原癌突变通常在胰腺导管腺癌中发生，KRAS突变会促使肿瘤起始、增殖、进展和转移。

在今年6月，Nature杂志曾发表了一篇文章（G12D，从而特异性高效靶向至胰腺癌细胞，以显著降低RAS活化、癌细胞增殖和转移过程。

药物递送丨工程化巨噬细胞外泌体装载紫杉醇，可有效靶向肺转移部位

非小细胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的85％，而且转移性NSCLC的预后很差；化疗后生存率只有很小的提高，五年存活率低于15％。

已知免疫细胞来源的外泌体会表达CD47受体，其与信号调节蛋白α（SIRPα）相互作用，能在吞噬细胞中产生“不吃我”的信号。

这些独特的功能使外泌体成为用作癌症治疗药物递送载体的有吸引力的选择。

已经表明，包括NSCLC的各种癌症类型，都会过表达膜结合蛋白sigma受体，其功能尚不清楚。

氨基乙基乙醇胺（aminoethylanisamide，AA）是sigma受体的高亲和力的配体，已被用于靶向递送Dox、蛋白质和siRNA。

然后，减少纳米药物免疫原性的最常见的方法是将纳米颗粒用聚乙二醇（PEG）修饰，这会减少单核吞噬细胞系统（MPS）的识别并有助于避免被清除。

并且发现，向外泌体中引入聚乙二醇，能显着增加了外泌体在小鼠体内的循环时间。

基于这些发现，研究人员认为，用PEG-AA载体修饰装载有紫杉醇的外泌体，将改善药物在血液中的循环时间并能够靶向肺转移。

与非载体修饰的exoPTX和紫杉醇相比，研究显示AA-外泌体的系统性给药，能在肺转移部位积累以及共定位，并且有更好的治疗效果。

因此，将纳米颗粒、靶向药物递送和低免疫原性特征结合起来，外泌体药物能够成为下一代的药物递送系统。

诊断

上海交大生命学院：

人唾液和血清外泌体蛋白质组的系统比较并用于肺癌检测

来自上海交通大学生命科学与技术学院的曹成喜和肖华课题组的研究人员在AnalyticaChimicaActa杂志发表论文，系统的比较了血清和唾液中外泌体的蛋白质组。

在进行外泌体分离之前，首先需要除去这些体液中的高丰度杂蛋白质，分离提取外泌体，并通过形态学分析和表面生物标志物检测进一步证实所获得的外泌体。

应用无标记的定量方法系统比较唾液和血清外泌体的蛋白质谱。

通过LC-MS/MS分别从唾液和血清中鉴定出319和994个外泌体蛋白。

为了探索其对癌症蛋白质组学的实用性，研究人员系统地比较了健康志愿者和肺癌患者的唾液和血清外泌体蛋白质组。

特别是在肺癌患者的两种体液中，找到了11种潜在候选蛋白。

该发现验证了癌症相关蛋白质在唾液和血清外泌体中存在的假说。

一旦这些候选蛋白被验证，基于循环外泌体的体液测试可以容易地被建立起来并最终用于癌症检测。

曹成喜和肖华等系统地比较了健康志愿者和肺癌患者的唾液和血清外泌体蛋白质组。

特别是在肺癌患者的两种体液中，找到了11种潜在检测候选蛋白。

一旦这些候选蛋白被验证，基于循环外泌体的体液测试可以容易地被建立起来并最终用于癌症检测。

参考文献：

SunY,LiuS,QiaoZ,ShangZ,XiaZ,NiuX,QianL,ZhangY,FanL,CaoCX,XiaoH.Systematiccomparisonofexosomalproteomesfromhumansalivaandserumforthedetectionoflungcancer.AnalChimActa.2017Aug22;982:

84-95.

外泌体诊断公司ExosomeDiagnostics发布最新液体活检技术突破性进展@BIO2017|C轮融资3000万美元

CDx项目---ExoDx使用临床验证的测定法通过患者分类筛选生物标志物。

ExoDx专利获批的长链RNA测序——提供血浆外泌体液体活检转录组分析技术。

外泌体Dx去除（和/或）富集（EDDE）平台——该技术具有选择识别特定组织类型来源的外泌体的能力，从而显著提高任何目标的信噪比。

ExoDxProstate（IntelliScore）®——这是一种完全无创性的尿液CLIALDT，旨在帮助医生识别具有灰色区域PSA（2-10ng/ml）的男性，他们可以避免不必要的前列腺活组织检查。

Shahky™——这是世界上第一个外泌体蛋白质捕获和分析仪器。

PSA-外泌体或可称为前列腺癌早期检测新方法

来自意大利迪桑尼塔高级研究所的研文章，验证了酸性环境——恶性肿瘤的一个关键表型，可以影响外泌体的释放并增加PCa细胞释放的纳米囊泡中的PSA表达水平。

为此，研究人员采用了纳米粒子追踪分析（NTA）方法、基于免疫捕获的ELISA和纳米流式细胞术等方法进行实验。

结果表明，酸性微环境诱导PSA和外泌体标志物CD81的表达以及纳米囊泡的释放增加。

为了验证细胞外酸性的局部选择压力引起的变化是否与临床表现相对应，研究人员使用相同的方法来评估PCa患者和对照组血浆中表达有PSA的外泌体的水平，对照组中包含有良性前列腺肥大（BPH）的受试者。

结果显示，只有PCa患者具有高水平表达CD81和PSA的纳米囊泡。

这项研究表明，肿瘤酸度造成选择性压力，导致表达PSA和外泌体标志物的细胞外囊泡的释放。

与BPH和健康对照相比，前列腺癌患者的血浆中显示了类似的情况。

这些结果表明，酸性微环境可能是定性和定量决定恶性肿瘤（包括前列腺癌）细胞外囊泡释放的关键因素。

这样，癌细胞分泌的纳米囊泡进入前列腺癌患者的外周血中，其中由外泌体表达的肿瘤生物标志物如PSA-外泌体可能代表了一种用于早期筛查诊断前列腺癌的新型非侵入性临床工具。

LogozziM等研究人员纳米粒子追踪分析（NTA）方法、基于免疫捕获的ELISA和纳米流式细胞术等方法来评估PCa患者和对照组血浆中表达有PSA的外泌体的水平，对照组中包含有良性前列腺肥大（BPH）的受试者。

结果显示，只有PCa患者具有高水平表达CD81和PSA的纳米囊泡。

这样，癌细胞分泌的纳米囊泡进入前列腺癌患者的外周血中，其中由外泌体表达的肿瘤生物标志物如PSA-外泌体可能代表了一种用于早期筛查诊断前列腺癌的新型非侵入性临床工具。

参考文献：

LogozziM,AngeliniDF,IessiE,MizzoniD,DiRaimoR,FedericiC,LuginiL,BorsellinoG,GentilucciA,PierellaF,MarzioV,S