分子生物学实验手册讲解.docx

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分子生物学实验手册讲解

微量加样器的使用及注意事项

1微量加样器的使用原理及分类

根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器（又称活塞冲程）;②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。

活塞冲程（空气垫）加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml之间。

加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。

因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。

一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。

以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应（PCR）测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。

活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。

2微量加样器的一般使用原则

加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。

（1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性（密度和黏度）的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。

（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。

由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。

可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。

（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。

（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。

当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。

例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。

而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。

因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。

然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。

一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。

对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：

①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。

当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也必须注意。

流体静压：

在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取的液体过多。

如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。

吸头润湿：

当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。

对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。

对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。

流体动力学：

对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。

为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。

如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。

尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。

此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。

3注意事项

实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。

连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。

3.1取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。

3.2操作时要慢和稳。

3.3连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。

3.4连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

3.5吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。

3.6改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。

3.7发现吸头内有残液时必须更换。

3.8新吸头使用前应先预测。

3.9为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：

①压放按钮时保持平衡；②加样器不得倒转；③吸头中有液体时不可将加样器平放；④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。

3.10勿用油脂等润滑活塞或密封圈。

3.11不可把容量计数调超其适用范围。

3.12液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。

3.13移液温度不得超过70℃。

3.14使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。

3.15连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

4.加样器的校准

加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测试方法。

这是目前用于此类仪器有效的校准方法。

4.1.适用加样器范围各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。

4.2.校准环境和用具要求

4.2.1室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。

4.2.2电子天平：

放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。

称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。

4.2.3小烧杯：

5-10ml体积。

4.2.4测定液体：

温度为20-25℃的去气双蒸水。

4.3.选定校准体积①拟校准体积；②加样器标定体积的中间体积；③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。

如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。

4.4.校准步骤

4.4.1将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。

4.4.2调节好天平。

4.4.3来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。

4.4.4垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。

4.4.5将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。

4.4.6将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。

4.4.7记录称量值。

4.4.8擦干吸头外面。

4.4.9按上述步骤称量10次。

4.4.10取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。

然后，按校准结果调节加样器。

4.5加样器的维护保养程序

加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：

4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。

清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。

4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。

4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。

4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：

压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。

4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。

田士军

实验一PCR

一、实验原理：

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

二、设备：

微量移液器（10μl）；离心机（Eppendorfcentrifuge541B）；PCR仪（Bio-RadS10000TMThermalcycler）

三、耗材：

吸头，1.5ml，200μlPCR八连管，

四、试剂和配制方法：

上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水，Kit：

天根生化[2×PfuMasterMixKp201（含有pfuDNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loadingbuffer）]。

五、步骤：

1．依次在管中加入：

（25μlPCR体系）按照kit的说明书：

Primer1（10uM）1μl

Primer2（10μM）1μl

2×MasterMix12.5μl

ddH2O9.5μl

Template1μl

注：

空白对照不加模板；其余先加ddH2O，最后加模板。

注意加样顺序：

ddH2O，Primer，2×MasterMix，Template。

2．瞬离，将样品甩至管底。

3．PCR参数：

94℃5min

35×（94℃25sec-60℃25sec-72℃30sec）

-72℃20min

（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72℃10min）若无需加A尾，只需72℃10min

4.立即电泳或保存于4℃

注意事项：

　　PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

（2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。

　　超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

　　（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。

　　（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。

配制试剂用新器具，用后作一次性处理。

　　（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。

　　（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。

加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。

加模板DNA后应更换手套。

　　（7）实验设阳性、阴性对照

（8）如要配多个管，配反应体系时应先在一个管中把所有共同的试剂混在一起，再分装到每个小管中，然后再加各自不同的模板或引物，这样省时省力，均一性好。

问题及解决办法：

1、出现假阳性的问题：

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。

造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。

常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。

解决办法：

（1）工作区隔离。

（2）改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。

（3）操作程序合理化，如后加阳性对照等。

2、假阴性的问题：

如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。

造成假阴性的原因包括:

（1）DNA抽提过程不当。

（2）DNA样品中含有Taq聚合酶抑制剂，如尿素、DMSO、SDS等物质，可抑制Taq酶活性，DNA样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响Taq酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。

设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。

在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。

3.不出现扩增条带：

（1）引物：

引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

解决办法：

①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

（2）Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

（3）靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

4.出现非特异性扩增带：

（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带出现的原因：

一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

（2）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

解决办法：

必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

5.出现片状拖带或涂抹带：

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

可能由于Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，GC含量过高引起。

解决办法：

适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数；加入添加剂甘油。

[肖硕,张秀娟]

实验二Agarose电泳

一、实验原理：

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。

把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。

由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。

凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。

在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。

三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：

超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE（见下）和TB（硼酸）E，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

Marker的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。

Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

二、设备：

移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电子秤，锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒

三、耗材：

PCR产物，质粒，枪头

四、试剂：

50×TAE缓冲液：

取242gTris（三羟甲基氨基甲烷）碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，100ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0），加入去离子水定容到1L。

取2ml50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml1×TAE稀释缓冲液备用。

1.5%琼脂糖

DNA相对分子质量标准样品：

DL2000。

Goldview溶液：

一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，3μl/100ml胶。

6×上样缓冲液（loadingbuffer）：

6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。

loadingbuffer的功能主要有两个。

第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。

SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。

商品化产品，贮存于4℃。

五、实验步骤：

1．制备胶液：

锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml1×TAE稀释缓冲液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。

2．制备胶板：

将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μlGoldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损失梳子底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板表面。

3．加样：

取25μlDNA样品（PCR产物中含有染液），用移液器小心加入样品槽中。

每加完一个样品要用电泳槽中的buffer清洗枪头，上样时要小心不要将样品槽底部凝胶刺穿，同时将10μl的DL2000点样，记录点样顺序。

4．电泳：

加完样后，合上电泳槽盖，连接好电线和电源，注意正负极，接通电源。

恒压100V，待阴极有气泡冒出才能离开。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

5．观察：

戴好手套小心取出电泳槽，滑出凝胶，放在一次性手套上，置于凝胶成像系统下观察，拍照。

6．清洁：

电泳用具，晾干。

六、注意事项

1、Marker的选择

Marker的选择要适中，Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。

2煮胶要完全，胶要摇匀

注意煮胶完全，不然有小颗粒会影响跑胶结果。

如果胶没有摇匀，跑胶的时候，相同的DNA的速度就不会相同，这样会出现弥散条带。

3、电泳跑完后，怎样看跑胶效果？

先看marker跑的怎样，如果marker跑的很好，没有弯曲，就说明整个电泳体系是没有问题的。

4、点样时别锉到胶。

5、条带模糊暗淡

电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。

特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。

如果是EB染色，可能是溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当（一般4℃避光保存一年内有效），或者终浓度没达到0．5vg／ml

七、讨论

1关于凝胶浓度的选择

琼脂浓度（%）

DNA相对分子质量（Kb）

0.3

5——60

0.6

1——20

0.7

0.8——1.0

0.9

0.5——7

1.2

0.4——6

1.5

0.2——3

2.0

0.1——2

2跑胶时候。

接近阴极的地方胶发黑？

ＴＡＥ的浓度太低，或者是误把水当成TAE，水不能导电，致使负极的胶碳化。

3加样时候，样品浮在缓冲液中，不能沉在加样孔里？

Loadingbuffer里的甘油浓度太低，又或者根本没加甘油。

八、琼脂糖凝胶电泳常见问题

常见问题

原因

对策

DNA条带模糊

DNA降解

实验过程避免核酸酶污染

电泳缓冲液陈旧

电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

TBE建议使用10次就更换缓冲液

所用电泳条件不合适

电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换

DNA上样量过多

减少凝胶中DNA上样量

DNA含盐过高

电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分

有蛋白污染

电泳前酚抽提去除蛋白

DNA变性

电泳前勿加热，用20mMNacl缓冲液稀释DNA

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

减少酶量，或调换另一来源的酶。

减少dNTP的浓度。

适当降低Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

不规则DNA带迁移

电泳条件不合适

电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换

DNA变性

电泳前勿加热，用20mMNacl缓冲液稀释DNA

带弱或无DNA带

DNA上样量不够

增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低

DNA降解

实验过程避免核酸酶污染

DNA跑出凝胶

缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度

EB染色的DNA，所用光源不合适

应用短波长（254nm）的紫外光源

DNA带缺失

DNA跑出凝胶

缩短电泳时间，降低电压，