蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响及p482蛋白多克隆抗体的制备.docx
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蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响及p482蛋白多克隆抗体的制备
北京协和医学院硕士学位论文
中英文缩略语表
ABTS2,2'-azino-di（3-ethylbenzothiazoline2,2’．联氮一双（3．乙基苯
sulfonate）并噻唑啉磺酸）
AmpAmpicillin氨苄青霉素
bpBasepair碱基对
CDKCyclin-dependentkinase周期蛋白依赖性激酶
CDSCodingsequence编码区
DABDiaminobenzidine3，3一四盐酸二氨基联苯胺
DAPI2·（4-Amidinophenyl）一6一indolecarbamidine联眯基苯吲哚酸盐
dihydrochloride
DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜
EDl’AEthyenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ELlSAenzyme—linkedimmunosorbentassay酶链免疫吸附实验FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素
Fn3Fibronectintype-III纤层蛋白Ill型
GFPgreenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白
GSTGlutathione．S．Trans；ferase谷胱甘肽硫转移酶
Hl冲horse-radishperoxidase辣根过氧化物酶
lPTGIsopropylthio-p-Dgalactoside异丙基-p-D一硫化半乳
糖苷
l①Kilodalton千道尔顿
LBLuriaBrothLB细菌培养基
MEMModifiedeaglemediumMEM培养基
ODopticaldensity光密度
PIAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液
PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应
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PIPropidiumiodide碘化丙啶
PMSFphenylmethysulfonyfluoride苯甲基磺酸钠
RGDArg-·Gly·-Asp精氨酸残基．甘氨酸残基．天氨酸残基
IU’-PCRReversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链反应
reaction
SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠
TEMEDN，N，N’，N'-tetramethylethylendiamineN，N，N’，N’，一四甲基乙二
胺三羟甲基氨
X．Gal5-bromo-4-chloro··3-·indolyl-·13··D5一溴．4．氯．3-吲哚一p—D一
galactoside半乳糖苷
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中文摘要
p48．2蛋白是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的免疫新分子。
本实验室从K562细胞中克隆出p48．2，并提交NCBIGenBank（DQ298450）。
p48．2基因定位在17q11．2，邻近NFl基因，在神经纤维瘤患者中，p48．2基因常与NFI基因一起缺失。
p48．2基因编码区全长1317bp，编码一个438个氨基酸的蛋白质。
在以往的研究中发现，p48．2在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在G0／G1期。
我们预测它是一种细胞周期负性调节因子，并进一步探讨了其分子机制。
生物信息分析显示：
p48．2基因进化高度保守，多种生物体内均有其同源蛋白。
它不具有跨膜结构域，也没有核定位信号和细胞器定位信号，是一种胞浆可溶性
蛋白质。
对p48．2结构域分析显示：
p48．2蛋白具有一个Fn3功能域，该功能域内部靠近C．末端，有一个RGD序列和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序。
RGD序列是整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞问的粘附作用，同时具有信号传导功能。
本课题的一部分工作是探讨p48．2蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响，具体研究如下：
1）利用PCR定点突变技术构建了RGD'-"RGE和RGD缺失的重组真核表达质粒pCMV-RGE和pCMV-DEL。
2）将pCMV-p48．2和两种突变质粒转染293T细胞，免疫荧光染色检测到p48．2及突变体均定位在细胞浆，充分表达后有向胞膜运动的趋势，RGD序列缺失后未影响p48．2蛋白的定位。
3）将p48．2基因和两种突变基因亚克隆入pEGFP-N1，利用GFP／DNA双标记流式细胞技术检测细胞周期，p48．2及其突变体均可诱导293T细胞G0／G1期停滞，S期减少。
4）将pCMV-p48．2和两种突变
质粒转染293T细胞，RT-PCR检测他们均能下调周期蛋白D1、D2的表达。
上述结果提示p48．2蛋白是一种胞浆蛋白，它在293T细胞中过量表达可以下调周期蛋白Dl、D2的表达，使细胞周期停滞在G0／G1。
RGD结构域未参与p48．2蛋白细胞内定位的调节，也没有影响p48．2蛋白抑制细胞周期、下调周期蛋白D1、D2的生物活性，因此RGD结构域不是p48．2蛋白的生物学活性的关键位点，这为进一步研究p48．2蛋白抑制细胞周期的分子机制做一铺垫。
本课题的另一部分工作是将p48．2基因克隆入原核表达载体pGEx—4T-l中，将重组质粒pGEX．p48．2导入大肠杆菌BL21，诱导表达GST融合蛋白，经GST亲合层析纯化蛋白。
获得的GST-p48．2融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备了多
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抗血清，经ELISA、Westernblot鉴定，该多抗血清具有较高效价，能与p48．2蛋白发生特异性反应。
p48．2多克隆抗体的成功制备为进一步研究p48．2的功能提供了一个有用的工具。
关键词：
p48．2、RGD序列、定点突变、细胞周期、原核表达、多克隆抗体
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Abstract
p48．2proteinisanovelimmunemoleculewhichhasaconservedmotifofcytokinereceptortypeI．WeclonedthisgenefromK562leukemiacells，andsubmittedittoNCBIGenBank（DQ298450）．p48．2geneislocalizedattheflankingregionofNFIgeneonchromosome17ql1．2thatisfrequentlydeletedinpatientswithneuroflbrominlocus．Thecodingsequenceforp48．2geneis1,317basepairthatencodea438aaprotein．Wehavedemonstratedthatover-expressedp48．2arrestedthecellcycleatG0／G1phase．Wefoundthatp48．2proteinmightbeanimportantnegativeregulatorincellcycle．Therefore，inthisstudy,wemakeafurtherexplorationonthemolecularmechanismconductedbyp48．2．
Bioinformaticanalysisshowsthattheevolutionofp48．2iswellconserved，homologuesofp48．2canbefoundinmanyvertebratespecies．p48．2isakindofsolublecytoplasmicproteinwithoutnuclearlocalizationsignal，cellorganellelocalizationsignalandtransmembranedomain．Theanalysisoffunctionaldomainshowsthatp48．2proteinhasatypicalFNIIIdomain．ARGDmotifandWSXWSmotifoftypeIcytokinereceptorareobservedattheC-terminusofFNllIdomain．
RGDmotifisknowntobeinteractingrecognitionsequencebetweencellsurfaceintegrinanditsligand，RGDmotifplaysancriticalroleincell-cellandcell。
matrixadhesion，andmediatescellsignalcommunications．OnepartofmystudyistodeterminewhetherRGDmotifistheimportantdomainforthebiologicalactivityofp48．2．Thefollowingapprocheswereemployed：
1）PCRsite·directedmutagenesiswasusedtoconstructeukaryoticexpressionvectorofRGD-to-RGEandRGDdeletionmutants，andnamedpCMV-RGEandpCMV-DEL，respectively．2）pCMV-p48．2andtwomutantplasidsweretransfectedtransientlyinto293Tcells．Immunostaininganalysisshowedthatbothp48．2anditsmutantderivetivesweredistributedincytoplasmandcellmembrance，andRGDmutationdidn’tchangethelocalizationofp48．2．3）p48．2geneanditsmutantderivetivesweresubclonedintopEGFP-N1．GFP／DNAmulti．parameterflowcytometryanalyzedthecellcycleof293TcelltransfectedwithpEGFP—p48．2，pEGFP—RGE，pEGFP-DEL，p48．2andmutantscould
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causeG0／G1phasearrestandreduceSphasepopulation．4）pCMV二p48．2andtwomutantsweretransfectedtransientlyinto293Tcells，allofthemcoulddown—regulatecyclinDIandD2expressionsbyreversedtranscription—PCR．Thesestudiesindicatethatp48。
2proteiniscytoplasmprotein，over-expressionofp48．2in293TcellcouldsignificantlyarresttheceilsatG0／G1phasebydown—regulatingcyclinDIandD2expressions．Thus，p48．2mightrepresentatypeofcytoplasmicproteinfunctioningasanegativeregulatorattheG0／G1phasebydown—regulatingcyclinDIandD2．RGD
mutationdidn’tchangethelocalizationofp48．2anditalsodidn’treleasep48．2一mediatedG0／G1arrestanddown—regulationofcyclinexpressions．ThereforeRGDmotifisnotnecessarytop48．2一mediatedcellcyclearrest．
Inanotherpartofmystudy,p48．2genewasalsosubclonedintopGEX一4T-l
vector．TheGST-p48．2fusionproteinwasexpressedinE．coliandpurifiedbyGSTaffinitychromatography．Thenwepreparedtherabbitanti—p48．2polyclonalserumwiththispurifiedsolublefusionprotein．Indirectenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）andWesternblotanalysisdemonstratedthatthep48．2proteinwasrecognizedbyrabbitpolyclonalserum．Inconclusion，weproducedpolycionalserumagainstp48．2protein．TheantibodyprovidesUSagoodtoolforfuturefunctional
characterizationofp48．2protein．
Keywords：
p48．2；RGDmotif；cellcycle；prokaryoticexpression；polyclonalantibody
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日Ⅱ百
p48．2蛋白的背景介绍
p48．2是我们利用I类细胞因子受体的保守结构域，通过在线BLAST，搜索到的一个新基因。
本实验室从人白血病细胞K562细胞系中克隆出p48．2Ill，并提交NCBIGenBank（DQ298450）。
该基因编码区全长1317bp，编码一个438个氨基酸的蛋白质，其分子量约为48．2l（D，因此命名为p48．2。
在NCBI上还可以检索到它的另外三个名字CRLF3（cytokinereceptor-likefactor3）、CREME9（cytokinereceptor-likemolecule9）、CYTOR4（cytokinereceptorrelatedprotein4）。
我们利用生物信息学对该蛋白进行了一些分析预测。
在NCBI上BlastP中进
行同源性检索，结果显示在多个物种体内，都有p48．2同源蛋白质存在，p48．2蛋白进化高度保守。
利用在线生物信息数据库PSORT对p48．2蛋白细胞内定位进行分析，结果显示它没有信号肽，没有核定位信号，没有线粒体、内质网和过氧化物酶体等细胞器定位滞留信号，没有DNA和RNA结合信号，也没有actin结合信号。
利用DAS进行跨膜结构分析，结果表明p48．2氨基酸序列中无跨膜区段，p48．2蛋白很可能是一种水溶性的胞浆蛋白。
PROSITE数据库分析显示p48．2蛋白在
，Ser216和Phe230之间有酪氨酸硫化位点（N．snhfedvyvgsetef-C），在Asn292和Glu295之间有一个糖基化位点。
对其结构域分析提示，p48．2蛋白在Arg。
76和Pr0261之间有一个重要的结构域Fn3（Fibronectintype—lII）结构域。
Fn3结构域内部靠近C-末端Ar9248和Asp250之间有RGD（Arg．Gly．Asp）J芋Y0，它是介导细胞与细胞外基质及细胞间相互作用的识别序列。
Fn3结构域内部靠近C．末端Trp255和Ser259之间有WSPWS（Trp．Ser-Xaa—Trp．Ser）基序，这一结构域常出现在I型细胞因子受体超家族。
p48．2基因定位在染色体17q11．2，邻近于NFI（neurofibromatosistype1）基因。
NFl基因编码的蛋白产物为神经纤维瘤素，它属于ras原癌基因的负调节因子蛋白家族，具有抑制肿瘤发生的作用‘21。
神经纤维瘤病是一种常染色体显性遗传病，主要与NFI基因的突变相关联，大多数患者是由于NFl基因内部缺失突变产生截断蛋白而导致该肿瘤发生【31。
5％的严重表现型患者有NFl基因及侧翼11个基因
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垫室堕塑堕堂堕堡主堂垡笙茎的大面积缺失，p48．2基因为其中之一【4J。
严重表现型的出现可能是与侧翼基因簇
的缺失有关而非NFl基因缺失本身。
目前缺失基因簇中的大部分基因功能尚不清楚，但是其中一些基因已经通过保守结构域分析预测可能参与了细胞生长的调节。
如RABllFIP4基因中有一个有丝分裂阻滞缺陷结构域（mitoticarrest．deficient，MAD），它可能参与细胞周期纺锤体检验点的调控，抑制染色体分离和细胞分裂。
而我们所研究的p48．2基因在本实验室前期的研究中发现，它在细胞中的过表达对细胞周期具有抑制作用，因此我们推测它是一种细胞周期负性调节因子，可能与神经纤维瘤的发病机制有一定的关系。
p48．2蛋白的结构域特点Fn3结构域是进化上非常古老的结构域，Petersen等首次在牛纤维粘连蛋白
（fibronectin，FN）中发现这一结构域【5】，随后研究发现它由约100个氨基酸构成。
在血浆纤维粘连蛋白有15个Fn3同源重复序列，纤维粘连蛋白分子与细胞表面整合素受体的结合主要是通过纤维粘连蛋白分子中第十个Fn3重复序列C．末端的RGD序列识别结合的【6一l。
目前已发现细胞内外的多种蛋白、受体、黏附分子、胶原蛋白等均具有Fn3结构域【8】，广泛参与细胞的生长分化、细胞黏附、信号传递、参与肿瘤转移等多种生物学功能。
Anastellin是一种由Fn3结构域衍生出来的
多肽，它在细胞内和动物模型中都具有抑制肿瘤发生和迁移的作用，其作用机制是抑制了胞外信号调节激酶（extracellularsignal．regulatedkinase，ErU（）信号转导途径的激活，从而抑制了细胞G1．S期的进展19J。
I类细胞因子受体是一种分布于细胞膜上的跨膜蛋白，在结构上是由胞外区、跨膜区、胞内区组成。
其中胞外区有一个细胞因子受体同源区域（cytokinereceptorhomology,CRH），该区域含有两个反平行的Fn3结构域。
同源区靠近N端有4个
保守的半胱氨酸残基，同源区靠近细胞膜处有一个高度保守的色氨酸．丝氨酸．X．色氨酸．丝氨酸基序（WSXWSmotif），这一区域是I类细胞因子受体识别配体、跨膜传递信号的关键部位flol。
但是由于p48．2不具有跨膜结构域，因而我们推测它可能不是受体类分子。
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j!
室堡塑堕堂堕堡主兰垡堡苎
精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸（Arg．Gly．Asp，RGD）序列广泛存在于细胞外基质蛋白和胞浆蛋白中【。
目前已发现细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）@有很多糖蛋白如玻璃连接蛋（vitronectin，VN）、层粘蛋I刍（1aminin）、纤维蛋白原（fibrinogen，Fb）、血管假性血友病因子（vonWillebrandfactor,vWF）、胶原蛋I兰l（collagen）和骨桥蛋f兰l（osteoponfin）等均为含RGD序列的蛋白【忆】。
RGD序列作为ECM蛋白与整合素受体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质ECM及细胞间的粘附作用。
但是仅有约5-6％的RGD蛋白是以膜受体蛋白和分泌型蛋白形式表达的，大部分含有RGD序列的蛋白是分布在细胞内的【13】，目前RGD结构域在胞浆蛋白中的功能尚不清楚。
近年来有些研究报道含有RGD结构域的胞浆蛋白有拮抗肿瘤侵袭的作用。
例如侵袭抑制蛋白（IIp45）是一种胞浆蛋白，邻近C末端有thyroglobulin．RGD结构域，通过这一结构域与胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP．1I）结合，抑制了恶性胶质瘤细胞的侵袭¨41。
细胞凋亡相关的蛋白酶procaspase．3在活化部位含有一个RGD结构域，并且在procaspase．3的分子中还发现有RGD的结合序列DDM，RGD和DDM的相互作用可以促进procaspase．3
的自身活化，从而导致细胞凋亡【15】。
目前国内外尚没有关于p48．2蛋白生物学功能的研究报道。
我们初步实验证明p48．2是胞浆表达的蛋白，而且它在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在G0／G1期。
那么p48．2在细胞中发挥调节细胞周期的分子机制是什么?
p48．2蛋白
中RGD结构域是否对它的生物学功能起到关键作用呢?
因此我们采用定点突变技术构建了RGD—RGE的突变体【16-181和RGD缺失突变体，探讨了RGD结构域与p48．2生物学活性的关系。
另外抗体也是研究蛋白功能的重要工具，目前还没有p48．2蛋白商品化的抗体出售，为了弥补这一缺憾，我们利用原核表达的重组蛋白制备了抗p48．2蛋白的兔多抗血清，为进一步研究p48．2蛋白的表达、定位和生物学功能奠定基础。
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试剂与材料
1．主要实验仪器
共聚焦显微镜上海徕卡仪器有限公司
倒置显微镜重庆光学仪器厂XSZ．D2型倒置显微镜
PCR仪美国PERKINELMER公司DNAThermalCycler
电泳仪美国Bio-Rad公司Model3000Xi
垂直式电泳槽北京六一仪器厂水平式电泳槽北京六一仪器厂DYY．III型
蛋白印迹转移槽北京六一仪器厂DPYp-40C型电泳槽水平摇床北京六一仪器厂WD．9405B型水平摇床
紫外分析仪上海康华生化仪器制造厂ZF型
洁净工作台北京半导体设备一厂
高速离心机德国eppendorfcentrifuge5410型台式高速离心机高速低温离心机美国Beckman公司
低速离心机北京医用离心机厂医用自动平衡离心机LDZ5．2型凝胶扫描仪英国UVI公司凝胶成像系统及分析软件
核酸定量分析美国Amersham公司Ultrospec2100pro核酸定量分析仪超
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