蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响及p482蛋白多克隆抗体的制备.docx

1、蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响及p482蛋白多克隆抗体的制备北京协和医学院硕士学位论文中英文缩略语表ABTS 2,2-azino-di(3-ethylbenzothiazoline 2,2联氮一双(3乙基苯sulfonate) 并噻唑啉磺酸)Amp Ampicillin 氨苄青霉素bp Base pair 碱基对CDK Cyclin-dependent kinase 周期蛋白依赖性激酶CDS Coding sequence 编码区DAB Diaminobenzidine 3，3一四盐酸二氨基联苯 胺DAPI 2(4-Amidinophenyl)一6一indolecarbamidine

2、联眯基苯吲哚酸盐dihydrochlorideDMSO dimethylsulfoxide 二甲基亚砜EDlA Ethyenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸 ELlSA enzymelinked immunosorbent assay 酶链免疫吸附实验 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素Fn3 Fibronectin type-III 纤层蛋白Ill型GFP green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白GST GlutathioneSTrans；ferase 谷胱甘肽硫转移酶Hl冲 horse-ra

3、dish peroxidase 辣根过氧化物酶lPTG Isopropyl thio-p-D galactoside 异丙基-p-D一硫化半乳糖苷l Kilodalton 千道尔顿LB Luria Broth LB细菌培养基MEM Modified eagle medium MEM培养基OD optical density 光密度PIAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应5北京协和医学院硕士学位

4、论文PI Propidium iodide 碘化丙啶PMSF phenylmethysulfony fluoride 苯甲基磺酸钠RGD Arg-Gly-Asp 精氨酸残基甘氨酸残 基天氨酸残基IU-PCR Reverse transcription-polymerase chain 反转录聚合酶链反应reactionSDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠TEMED N，N，N，N-tetra methylethylen diamine N，N，N，N，一四甲基乙二胺三羟甲基氨XGal 5-bromo-4-chloro3-indolyl-13D 5一溴4氯3-吲哚

5、一pD一galactoside 半乳糖苷6北京协和医学院硕士学位论文中文摘 要p482蛋白是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的免疫新分子。本实验室 从K562细胞中克隆出p482，并提交NCBI GenBank(DQ298450)。p482基因定 位在17q112，邻近NFl基因，在神经纤维瘤患者中，p482基因常与NFI基因一 起缺失。p482基因编码区全长1317 bp，编码一个438个氨基酸的蛋白质。在以 往的研究中发现，p482在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在G0G1期。我 们预测它是一种细胞周期负性调节因子，并进一步探讨了其分子机制。生物信息分析显示：p482基因进化高度保守，

6、多种生物体内均有其同源蛋白。 它不具有跨膜结构域，也没有核定位信号和细胞器定位信号，是一种胞浆可溶性蛋白质。对p482结构域分析显示：p482蛋白具有一个Fn3功能域，该功能域内 部靠近C末端，有一个RGD序列和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序。RGD序列是整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及 细胞问的粘附作用，同时具有信号传导功能。本课题的一部分工作是探讨p482 蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响，具体研究如下：1)利用PCR定点突 变技术构建了RGD-RGE和RGD缺失的重组真核表达质粒pCMV-RGE和 pCMV-DEL。2)将pCMV-p482和两种突变质

7、粒转染293T细胞，免疫荧光染色 检测到p482及突变体均定位在细胞浆，充分表达后有向胞膜运动的趋势，RGD 序列缺失后未影响p482蛋白的定位。3)将p482基因和两种突变基因亚克隆入 pEGFP-N1，利用GFPDNA双标记流式细胞技术检测细胞周期，p482及其突变 体均可诱导293T细胞G0G1期停滞，S期减少。4)将pCMV-p482和两种突变质粒转染293T细胞，RT-PCR检测他们均能下调周期蛋白D1、D2的表达。上述 结果提示p482蛋白是一种胞浆蛋白，它在293T细胞中过量表达可以下调周期蛋 白Dl、D2的表达，使细胞周期停滞在G0G1。RGD结构域未参与p482蛋白细 胞内定

8、位的调节，也没有影响p482蛋白抑制细胞周期、下调周期蛋白D1、D2 的生物活性，因此RGD结构域不是p482蛋白的生物学活性的关键位点，这为进 一步研究p482蛋白抑制细胞周期的分子机制做一铺垫。本课题的另一部分工作是将p482基因克隆入原核表达载体pGEx4T-l中， 将重组质粒pGEXp482导入大肠杆菌BL21，诱导表达GST融合蛋白，经GST 亲合层析纯化蛋白。获得的GST-p482融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备了多1北京协和医学院硕士学位论文抗血清，经ELISA、Western blot鉴定，该多抗血清具有较高效价，能与p482蛋 白发生特异性反应。p482多克隆抗体的成功制备为

9、进一步研究p482的功能提供 了一个有用的工具。关键词：p482、RGD序列、定点突变、细胞周期、原核表达、多克隆抗体2北京协和医学院硕士学位论文Abstractp482 protein is a novel immune molecule which has a conserved motif of cytokine receptor type IWe cloned this gene from K562 leukemia cells，and submitted it to NCBI GenBank(DQ298450)p482 gene is localized at the flankin

10、g region of NFI gene on chromosome 1 7q l 12 that is frequently deleted in patients with neuroflbrominlocusThe coding sequence for p482 gene is 1,3 1 7 base pair that encode a 43 8aa proteinWe have demonstrated that over-expressed p482 arrested the cell cycle at G0G 1 phaseWe found that p482 protein

11、 might be an important negative regulator in cell cycleTherefore，in this study,we make a further exploration on the molecular mechanism conducted by p482Bioinformatic analysis shows that the evolution of p482 is well conserved， homologues of p482 can be found in many vertebrate speciesp482 is a kind

12、 of soluble cytoplasmic protein without nuclear localization signal，cell organelle localization signal and transmembrane domainThe analysis of functional domain shows that p482 protein has a typical FNIII domainA RGD motif and WSXWS motif of type I cytokine receptor are observed at the C-terminus of

13、 FNllI domainRGD motif is known to be interacting recognition sequence between cell surface integrin and its ligand，RGD motif plays an critical role in cell-cell and cell。matrix adhesion，and mediates cell signal communicationsOne part of my study is to determine whether RGD motif is the important do

14、main for the biological activity of p482The following approches were employed：1)PCR sitedirected mutagenesis was used to construct eukaryotic expression vector of RGD-to-RGE and RGD deletion mutants，and named pCMV-RGE and pCMV-DEL，respectively2)pCMV-p482 and two mutant plasids were transfected trans

15、iently into 293T cellsImmunostaining analysis showed that both p482 and its mutant derivetives were distributed in cytoplasm and cell membrance，and RGD mutation didnt change the localization of p4823)p482 gene and its mutant derivetives were subcloned into pEGFP-N 1 GFPDNA multiparameter flow cytome

16、try analyzed the cell cycle of 293T cell transfected with pEGFPp482，pEGFPRGE，pEGFP-DEL，p482 and mutants could3北京协和医学院硕士学位论文cause G0G 1 phase arrest and reduce S phase population4)pCMV二p482 and two mutants were transfected transiently into 293T cells，all of them could downregulate cyclin DI and D2 ex

17、pressions by reversed transcriptionPCRThese studies indicate that p48。2 protein is cytoplasm protein，over-expression of p482 in 293T cell could significantly arrest the ceils at G0G 1 phase by downregulating cyclin D I and D2 expressionsThus，p482 might represent a type of cytoplasmic protein functio

18、ning as a negative regulator at the G0G1 phase by downregulating cyclin D I and D2RGDmutation didnt change the localization of p482 and it also didnt release p482一mediated G0G 1 arrest and downregulation of cyclin expressionsTherefore RGD motif is not necessary to p482一mediated cell cycle arrestIn a

19、nother part of my study,p482 gene was also subcloned into pGEX一4T-lvectorThe GST-p482 fusion protein was expressed in Ecoli and purified by GST affinity chromatographyThen we prepared the rabbit antip482 polyclonal serum with this purified soluble fusion proteinIndirect enzyme-linked immunosorbent a

20、ssay (ELISA)and Western blot analysis demonstrated that the p482 protein was recognized by rabbit polyclonal serumIn conclusion，we produced polycional serum against p482 proteinThe antibody provides US a good tool for future functionalcharacterization of p482 proteinKeywords：p482；RGD motif；cell cycl

21、e；prokaryotic expression；polyclonal antibody4北京协和医学院硕士学位论文日 百p482蛋白的背景介绍p482是我们利用I类细胞因子受体的保守结构域，通过在线BLAST，搜索到 的一个新基因。本实验室从人白血病细胞K562细胞系中克隆出p482 Ill，并提交 NCBI GenBank(DQ298450)。该基因编码区全长1317bp，编码一个438个氨基酸 的蛋白质，其分子量约为482 l(D，因此命名为p482。在NCBI上还可以检索到 它的另外三个名字CRLF3(cytokine receptor-like factor 3)、CREME9(cy

22、tokine receptor-like molecule 9)、 CYTOR4(cytokine receptor related protein 4)。我们利用生物信息学对该蛋白进行了一些分析预测。在NCBI上BlastP中进行同源性检索，结果显示在多个物种体内，都有p482同源蛋白质存在，p482蛋 白进化高度保守。利用在线生物信息数据库PSORT对p482蛋白细胞内定位进行 分析，结果显示它没有信号肽，没有核定位信号，没有线粒体、内质网和过氧化 物酶体等细胞器定位滞留信号，没有DNA和RNA结合信号，也没有actin结合信 号。利用DAS进行跨膜结构分析，结果表明p482氨基酸序列中无

23、跨膜区段，p482 蛋白很可能是一种水溶性的胞浆蛋白。PROSITE数据库分析显示p482蛋白在， Ser216和Phe230之间有酪氨酸硫化位点(Nsnhfedvyvgsetef-C)，在Asn292和Glu295 之间有一个糖基化位点。对其结构域分析提示，p482蛋白在Arg。76和Pr0261之 间有一个重要的结构域Fn3(Fibronectin typelII)结构域。Fn3结构域内部靠近C- 末端Ar9248和Asp250之间有RGD(ArgGlyAsp)J芋Y0，它是介导细胞与细胞外基质 及细胞间相互作用的识别序列。Fn3结构域内部靠近C末端Trp255和Ser259之间有 WSP

24、WS(TrpSer-XaaTrpSer)基序，这一结构域常出现在I型细胞因子受体超家 族。p482基因定位在染色体17q112，邻近于NFI(neurofibromatosis type 1)基因。 NFl基因编码的蛋白产物为神经纤维瘤素，它属于ras原癌基因的负调节因子蛋白 家族，具有抑制肿瘤发生的作用21。神经纤维瘤病是一种常染色体显性遗传病， 主要与NFI基因的突变相关联，大多数患者是由于NFl基因内部缺失突变产生截 断蛋白而导致该肿瘤发生【31。5的严重表现型患者有NFl基因及侧翼11个基因7垫室堕塑堕堂堕堡主堂垡笙茎 的大面积缺失，p482基因为其中之一【4J。严重表现型的出现可能是

25、与侧翼基因簇的缺失有关而非NFl基因缺失本身。目前缺失基因簇中的大部分基因功能尚不清 楚，但是其中一些基因已经通过保守结构域分析预测可能参与了细胞生长的调节。 如RABllFIP4基因中有一个有丝分裂阻滞缺陷结构域(mitotic arrestdeficient， MAD)，它可能参与细胞周期纺锤体检验点的调控，抑制染色体分离和细胞分裂。 而我们所研究的p482基因在本实验室前期的研究中发现，它在细胞中的过表达对 细胞周期具有抑制作用，因此我们推测它是一种细胞周期负性调节因子，可能与 神经纤维瘤的发病机制有一定的关系。p482蛋白的结构域特点 Fn3结构域是进化上非常古老的结构域，Peters

26、en等首次在牛纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)中发现这一结构域【5】，随后研究发现它由约100个氨基酸构成。 在血浆纤维粘连蛋白有15个Fn3同源重复序列，纤维粘连蛋白分子与细胞表面整 合素受体的结合主要是通过纤维粘连蛋白分子中第十个Fn3重复序列C末端的 RGD序列识别结合的【6一l。目前已发现细胞内外的多种蛋白、受体、黏附分子、 胶原蛋白等均具有Fn3结构域【8】，广泛参与细胞的生长分化、细胞黏附、信号传 递、参与肿瘤转移等多种生物学功能。Anastellin是一种由Fn3结构域衍生出来的多肽，它在细胞内和动物模型中都具有抑制肿瘤发生和迁移的作用，其作用机制 是抑制了胞外信号调

27、节激酶(extracellular signalregulated kinase，ErU()信号转导途 径的激活，从而抑制了细胞G1S期的进展19J。I类细胞因子受体是一种分布于细胞膜上的跨膜蛋白，在结构上是由胞外区、 跨膜区、胞内区组成。其中胞外区有一个细胞因子受体同源区域(cytokine receptor homology,CRH)，该区域含有两个反平行的Fn3结构域。同源区靠近N端有4个保守的半胱氨酸残基，同源区靠近细胞膜处有一个高度保守的色氨酸丝氨酸X 色氨酸丝氨酸基序(WSXWS motif)，这一区域是I类细胞因子受体识别配体、跨 膜传递信号的关键部位flol。但是由于p482不

28、具有跨膜结构域，因而我们推测它 可能不是受体类分子。8j!室堡塑堕堂堕堡主兰垡堡苎精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)序列广泛存在于细胞外基质蛋 白和胞浆蛋白中【 。目前已发现细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)有很多糖 蛋白如玻璃连接蛋(vitronectin，VN)、层粘蛋I刍(1aminin)、纤维蛋白原(fibrinogen， Fb)、血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、胶原蛋I兰l(collagen)和骨桥 蛋f兰l(osteoponfin)等均为含RGD序列的蛋白【忆】。RGD序列作为ECM蛋白与整合

29、素受体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质ECM及细胞间的粘附作用。但是仅有约5-6的RGD蛋白是以膜受体蛋白和分泌型蛋白形式表达的，大部分 含有RGD序列的蛋白是分布在细胞内的【13】，目前RGD结构域在胞浆蛋白中的功 能尚不清楚。近年来有些研究报道含有RGD结构域的胞浆蛋白有拮抗肿瘤侵袭 的作用。例如侵袭抑制蛋白(IIp45)是一种胞浆蛋白，邻近C末端有 thyroglobulinRGD结构域，通过这一结构域与胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP1I)结合，抑制了恶性胶质瘤细胞的侵袭41。细胞凋亡相关的蛋白酶 procaspase3在活化部位含有一个RGD结构域，并且在procas

30、pase3的分子中还 发现有RGD的结合序列DDM，RGD和DDM的相互作用可以促进procaspase3的自身活化，从而导致细胞凋亡【15】。目前国内外尚没有关于p482蛋白生物学功能的研究报道。我们初步实验证 明p482是胞浆表达的蛋白，而且它在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在 G0G1期。那么p482在细胞中发挥调节细胞周期的分子机制是什么?p482蛋白中RGD结构域是否对它的生物学功能起到关键作用呢?因此我们采用定点突变 技术构建了RGDRGE的突变体【16-181和RGD缺失突变体，探讨了RGD结构域 与p482生物学活性的关系。另外抗体也是研究蛋白功能的重要工具，目前还没有 p4

31、82蛋白商品化的抗体出售，为了弥补这一缺憾，我们利用原核表达的重组蛋白 制备了抗p482蛋白的兔多抗血清，为进一步研究p482蛋白的表达、定位和生物 学功能奠定基础。9北京协和医学院硕士学位论文试剂与材料1主要实验仪器共聚焦显微镜 上海徕卡仪器有限公司倒置显微镜 重庆光学仪器厂XSZD2型倒置显微镜PCR仪 美国PERKIN ELMER公司DNA Thermal Cycler电泳仪 美国Bio-Rad公司Model 3000Xi垂直式电泳槽 北京六一仪器厂 水平式电泳槽 北京六一仪器厂DYYIII型蛋白印迹转移槽 北京六一仪器厂DPY p-40C型电泳槽 水平摇床 北京六一仪器厂WD9405B型水平摇床紫外分析仪 上海康华生化仪器制造厂ZF型洁净工作台 北京半导体设备一厂高速离心机 德国eppendorfcentrifuge 5410型台式高速离心机 高速低温离心机 美国Beckman公司低速离心机 北京医用离心机厂医用自动平衡离心机LDZ52型 凝胶扫描仪 英国UVI公司凝胶成像系统及分析软件核酸定量分析 美国Amersham公司Ultrospec 2100 pro核酸定量分析仪 超