设计荧光量子点法降钙素原PCT试剂盒的研制.docx

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设计荧光量子点法降钙素原PCT试剂盒的研制

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《专业课程设计》

荧光量子点法降钙素原（PCT）试剂盒的研制

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摘要

本产品运用免疫层析法的夹心免疫技术将量子点与PCT单克隆抗体结合，建立一种新型的免疫分析法进行特异性定性检测人血清或血浆中的PCT，使灵敏度显著提高，达到或超过某些酶联免疫吸附法（ELISA）的水平。

由于待检测PCT与PCT抗体的反应，使得水溶性量子点的荧光强度产生变化，通过测定水溶性量子点荧光强度变化的量来实现对待检测PCT浓度的高选择性定量检测。

本发明中的降钙素原（PCT）检尝试剂盒具有制备低廉、稳定性好、易于保存，利用荧光量子点标记方法检测灵敏度高、特异性强的优点，比较容易的在临床进行推广。

1.研究背景

目前临床和科研实验室中均用免疫学方法检测PCT浓度，包括胶体金法、ELISA法和免疫化学发光法等。

所有这些方法的前提都是制备PCT特异性抗体，且健康人血浆中含量极低，在200pg/mL以下，对抗体的亲和力等参数要求很高。

迄今为止这些检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。

因此，制备PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供具有自主知识产权的关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。

目前应用化学发光免疫分析技术建立人血清中降钙素原定量检测方法，采用固相包被降钙素原单克隆抗体，生物素标记另一降钙素原单克隆抗体，建立人血清中降钙素原的双抗体夹心化学发光免疫定量检测方法。

在此基础上，荧光免疫分析技术是利用荧光物质标记抗体或者抗原分子，通过与待分析物的特异性结合后，检测荧光信号的强度变化，实现对目标分析物的定性和定量检测。

制备荧光信号强、免疫活性好的量子点-抗体（QD-Ab）复合物是将量子点应用于荧光免疫检测的关键。

QD-Ab的荧光信号放大效率主要是由量子点—抗体偶联比例以及量子点本身的荧光量子效率决定，而其免疫活性则由QD表面偶联的抗体分子的量效决定，除了抗体自身亲和力对复合物的免疫活性产生影响外，抗体与量子点间的偶联位点和抗体分子在量子点表面的空间构象也对QD—Ab复合物的免疫活性有重要影响。

2.PCT简介及临床意义

PCT（降钙素原，procalcitonin）是一种无激素活性的降钙素前肽物质，来自于定位11号染色体上的单拷贝基因，该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，相对分子质量约为13×103。

在正常代谢下，甲状腺C细胞产生PCT并分泌激素活性的降钙素。

正常人血中PCT浓度极低，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。

在自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高；局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症也不会导致其升高。

自1993年Assicot等首次报道PCT可作为细菌感染的早期标志物以来，PCT作为一个新的炎症指标广泛应用于细菌感染的诊断与鉴别诊断，2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标之一。

PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。

但是，在这些病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。

从肠道释放细胞因子或细菌移位可能诱导其升高。

PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。

它的测定可以作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。

3.量子点技术简介及研究进展

量子点（quantumdots，QDs）是纳米尺寸的半导体微粒，又称为半导体纳米晶体（nanocrystals，NCs），是一种由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的、稳定的、溶于水的、直径在2～10nm之间的纳米晶粒。

当半导体材料减小到纳米尺寸时，它与大块材料相比具有独特的光学特性。

目前，量子点最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光探针。

QD的光学特性比传统的荧光染料探针有明显的优越性：

（1）量子点被激发后可得到波长范围宽且光谱可调的荧光。

（2）量子点粒径大小不同，所激发的荧光也不相同。

（3）不同大小的量子点可以用同一波长的光激发而发出不同颜色的光，这将给生物学的研究带来很大的方便。

由于量子点半峰宽较窄，这就允许使用不同光谱特征的量子点，而发光色谱不发生重叠或重叠较小，可用于多种标记物的同时检测生物体内的几种组分。

量子点具有很多的优点，如能解决量子点与生物分子的偶联问题，就可以用量子点代替有机荧光染料，在细胞器定位、信号传导、原位杂交、胞内分子的运动和迁移等研究中发挥巨大的作用。

量子点的制备方法有很多，用于生物荧光探针的量子点通常采用胶体化学法——按所用的原料不同可以分为金属有机溶剂热分解和巯基分子作稳定剂的水相合成两种路线。

对用于生物检测的纳米晶体的要求是可溶于水或缓冲溶液，粒径分布均匀，量子产率高，并且稳定。

因此制备发光效率高、发光颜色可调性好、对光热稳定性好的量子点，尤其是制备对于生物检测十分重要的受激发能在红外区发光的量子点已成为近年来的研究热点。

量子点作为荧光探针使用时，其表面需要修饰生物分子，如抗体、多肽、糖类等。

如何将生物分子有效的偶联在量子点表面并保持其生物活性，是量子点生物学应用中极为关键的一步。

到目前为止，已经有一些类型的偶联技术在量子点抗体偶联中应用。

量子点的制备方法通常分为物理方法和化学方法两种。

用于生物探针的量子点的合成方法主要采用胶体化学法，通过在胶体溶液中进行纳米晶体的制备，一类是在高沸点的有机溶剂中利用前驱体（烷基（非）金属）热分解来合成，另一类是利用稳定剂（巯基小分子）在水溶液中合成。

采用胶体化学法在有机溶剂中合成的量子点在用于生物标记时必须对量子点进行表面修饰，使其具有一定的水溶性和生物相容性，同时在量子点表面连接上可与生物分子连接的功能性基团，可引入极性的官能团（如氨基或羧基等），再通过交联剂NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）或EDC（乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亚胺），完成量子点与生物大分子（蛋白质、核酸、酶等）的共价偶联。

目前量子点标记最为活跃的领域是在荧光免疫方面。

借助于抗原—抗体、生物素—亲和素等之间的特异性识别作用完成各种研究。

QDs稳定性好，荧光杂质少，连接于生物分子后不影响其活性，特异性高。

4.产品技术及待解决问题

本项目参考CN1A中的方法将降钙素原检尝试纸，作为一种量子点标记免疫定量检尝试纸，包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构，各层膜结构之间部分重叠；所述结合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、以及量子点标记的兔IgG；所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线、以及一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线。

该试纸可方便快捷、准确定量地同时检测降钙素原。

本发明同时参考一种降钙素原的化学发光定量检尝试剂盒及其制备方法和检测方法，用以巯基丙酸（MPA）作为稳定剂合成的水溶性量子点CdSe纳米粒子，用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将量子点活化，用EDC（乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亚胺）完成量子点与PCT抗体的共价偶联。

CdSe量子点表面覆盖有巯基乙酸，在水溶性缩合剂EDC的作用下与抗体的氨基反应，使抗体以共价键连到量子点表面。

用修饰过的QDs标记单抗，而此标记不影响PCT单抗与多克隆抗体的反应，标记后的PCT抗体仍然具有生物活性。

EDC与羧基反应形成氨基反应活性的中间体—O-酰基脲，该中间体很不稳定，在水中会很快水解释放出羧基，以及一N-酰基脲。

该副反应所产生的N-酰基脲会结合在蛋白疏水区域的羧基上，而NHS介入的反应，可以使形成的中间体在水溶液中保持稳定。

整个偶联过程简单，条件温和，量子点的荧光强度几乎不受影响。

偶联过程中，会有小部分量子点和抗体发生交联，生成大颗粒物，反应后离心即可去除。

降钙素原测定试剂盒（荧光量子点法）项目设计方案

1设计目的和依据：

目的：

本发明目的在于提供一种利用荧光量子点法定量检测降钙素原（PCT）的试剂盒，PCT作为一种能直观反映全身炎症反应的活跃程度的蛋白而备受关注。

目前市场上运用荧光量子点法检测降钙素原（PCT）的产品较少，而该种方法相较于其他化学检测方法拥有更加灵敏准确的优势，相较于其他物理检测方法也有着对设备加工工艺要求较低的优势。

依据：

专利：

[1]、CN

[2]、CN

[3]、CN

[4]、CN

[5]、CN

[6]、CN

文献：

[1]宋健,范佳,宋大千,毕丽荣,周广宇,张皓,魏景艳,杨柏.量子点偶联抗体型夹心免疫传感法检测心肌肌钙蛋白I[J].高等学校化学学报,2009,10:

1940-1944.

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523-526.

[3]张鹏飞,宋杰,陈佳,陆慧琦,韩焕兴.量子点与抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体的偶联研究[J].分析化学,2013,06:

846-850.

[4]邢仕歌,熊齐荣,钟强,张悦,卞素敏,金涌,储晓刚.量子点抗体偶联技术研究进展[J].分析化学,2013,06:

949-955.

[5]马慧莲.发光CdTe量子点生物偶联产物制备、性质及应用研究[D].东北大学,2005.

[6]白亚龙.一种基于量子点荧光微球的高灵敏度免疫层析技术初步研究[D].上海师范大学,2010.

[7]谢颖,徐静娟,于俊生,陈洪渊.水溶性的CdSe/ZnS纳米微粒的合成及表征[J].无机化学学报,2004,06:

663-667.

[8]邱婷,彭洪亮,何治柯.水溶性量子点CdSe/ZnS与蛋白质非特异性相互作用研究[J].化学传感器,2007,02:

26-30.

[9]胡晓武,李之珍,田雪,刘辉宇.胶体金法测定降钙素原试剂盒的研究[J].中华全科医学,2014,02:

271-273.

[10]谢玉玲,戴振贤,柳丽娟,许胜,薛正翔,吴玉水.降钙素原化学发光免疫定量检测方法的建[11]ShehabiYahya,SeppeltIan.Pro/Condebate:

isprocalcitoninusefulforguidingantibioticdecisionmakingincriticallyillpatients?

[J].CriticalCare（Online）,2008,123:

211.

[12]Xiao-FengHua,Tian-CaiLiu,Yuan-ChengCao,BoLiu,Hai-QiaoWang,Jian-HaoWang,Zhen-LiHuang,Yuan-DiZhao.Characterizationofthecouplingofquantumdotsandimmunoglobulinantibodies[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2006,3866:

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[13]SniderRH,NylenES,BeckerKL.Procalcitoninanditscomponentpeptidesinsystemicinflammation:

immunochemicalcharacterization.[J].Journalofinvestigativemedicine:

theofficialpublicationoftheAmericanFederationforClinicalResearch,1998,459:

552-600.

立及临床应用价值[J].福建医药杂志,2013,06:

10-12.

说明书：

参照罗氏厂家试剂盒说明书。

2开发过程遵循标准：

[1]《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》（局令第10号）

[2]GB/T15000.2-94标准样品工作导则

[3]JJF1005-2005标准物质常用术语和定义

[4]YY0648-2008测量、控制和试验室用电气设备的安全要求第2-101部分：

体外诊断（IVD）医用设备的专用要求

[5]临床化学体外诊断试剂盒通用技术要求

[6]JJF1001-1998通用计量术语及定义

[7]GBT19703体外诊断医学器具-生物源样品中量的测量-参考物质的说明

[8]GBT19702-2005体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量参考测量程序的说明

[9]WS-T124-1999临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则

[10]YY/T0638-2008/ISO18153:

2003体外诊断医疗器械-生物样品中量的测量-校准品和控制物质中酶催化浓度赋值的计量学溯源性

[11]EN9802003

[12]GB9969-1-1998工业产品使用说明书总则

[13]GBT21415-2008体外诊断医疗器械-生物样品中量的测量-校准品和控制物质赋值的计量学溯源性

[14]JJG810-1993《波长色散X射线荧光光谱仪》

[15]GB/T13551-1995火焰原子吸收光谱法

[16]GB/T31364-2015能量色散X射线荧光光谱仪主要性能测试方法

3知识产权评估和论述：

本项目采用的ODs标记抗体的技术为国内和国际通用技术。

本设计依据罗氏诊断降钙素原（PCT）说明书（001V1）中荧光量子点标记抗体的原理，及其双抗体夹心法的方式参考研制而成。

4临床意义

PCT（降钙素原，procalcitonin）是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，它在血浆中的水平升高。

自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。

局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症也不会导致其升高。

PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。

影响PCT水平的因素包括：

被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。

另外，PCT只是在少数患者的大型外科术后1~4d可以测到。

PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。

但是，在这些病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。

5原理

本试剂是利用免疫双抗体夹心法测定分析方法来定性检测人血清或者血浆中的PCT。

首先，用EDC/NHS的欧联作用将ODs标记到Anti-PCT单克隆抗体（标记抗体，一抗①）上同时包被于固相载体上，当样品中的PCT与标记抗体结合后，利用检测线上的另一种Anti-PCT单克隆抗体（一抗②）来捕捉结合了标记抗体的PCT，并设置质控线，质控线上设有抗Anti-PCT单克隆抗体（一抗①）的抗体（二抗），用来捕捉未和PCT结合的标记抗体，来对照说明试剂条的质量稳定，形成“抗体——抗原——抗体”复合物，之后激发量子点发出荧光，样本中的PCT含量与系统所检测的相对荧光强度成正比，从而测出样品中PCT含量。

6技术创新点

（1）相较于CRP等蛋白检测，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度且更为灵敏。

（2）相较于物理检测方法，荧光检测更为便捷，对设备及加工工艺要求较低。

（3）相较于化学检测方法，荧光检测检出限低，更为灵敏准确。

7仿制试剂理化指标分析（后附《血液中降钙素原（PCT）荧光量子点试剂盒项目仿制试剂理化指标测试报告》）

8基础配方及配方中各物质的作用

（1）固相试剂

名称

含量（mmol/L）

分子量

每毫升用量

作用

牛血清白蛋白

0.0147

68000

0.1g

封闭剂

MES

100

213.5

0.1g

缓冲液成分

氢氧化钠

100

39.9971

—

缓冲液成分

Anti-PCT单抗②（一抗②）

—

—

4.5g

检测线抗体

抗Anti-PCT单抗①（二抗）

—

—

4.5g

质控线抗体

（2）标记试剂：

名称

含量（mmol/L）

分子量

每毫升用量

作用

MES

100

213.5

0.1g

缓冲液成分

氢氧化钠

100

39.9971

—

缓冲液成分

EDC

100

191.70

0.0197g

偶联剂

NHS

100

115.09

0.01151g

活化剂

Cys

—

121.15

—

稳定剂

Anti-PCT单抗①（一抗①）

—

—

4.5g

被标记抗体

ODs

0.001

—

—

标记物

（3）洗涤试剂：

名称

含量（mmol/L）

分子量

每升用量

作用

MES

100

213.5

0.1g

缓冲液成分

氢氧化钠

100

39.9971

—

缓冲液成分

9关键技术及解决方案

关键技术：

此试剂盒的关键技术分为以下几个方面，

（1）特异性：

本方案要求特异性既达到要求又节省成本，特异性不合格会影响临床测值出现假阳性。

（2）灵敏度：

灵敏度是产品的一个重要指标，用来判定产品测定样本的敏感程度。

（3）稳定性：

本方案要求试剂稳定性要求达到12个月。

解决方案：

（1）特异性：

A筛选抗原：

筛选不同厂家的标记抗体，一抗②，以及二抗。

B量子点的选择

运用双抗体夹心法提高检测时的专一性和准确性。

（2）灵敏度：

A定向包被

乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亚胺，其表面的的氨基（NH2）直接与蛋白质或多肽共价结合，实现抗体的定向包被，不再需要表面活化，提高试剂灵敏度。

B确定检测线和质控线相关指标

实验确定T线包被浓度，实验确定C线包被浓度，实验确定C、T线在NC膜上的合理距离关系。

CEDC/NHS偶联

EDC和NHS一旦偶联则很难分离，经NHS活化后的ODs在EDC作用下在其表面可以结合多个Anti-PCT抗体，增加了检测时的捕捉能力，从而提高灵敏度。

D非蛋白封闭剂的应用

新型的非蛋白型封闭剂，不仅可以比传统的蛋白型封闭剂更进一步降低背景，提高实际灵敏度，同时由于不含蛋白，保存也很简单，放在室温也不用担心蛋白降解或长菌变质。

E多聚BSA应用

多聚BSA消除非特异性干扰引起的背景问题，能阻断检测组分与固相的非特异性链接，从而降低背景信号并改善检测的灵敏度。

BSA多聚体带有阴性电荷，适用于多价干扰的清除，如多价抗体/聚合物或抗原。

（3）稳定性：

固相、标记试剂为含具有生物活性抗体的液体试剂，为维持试剂的稳定性，可通过加入以下几种物质：

A稳定剂

固相试剂和标记试剂中均含有抗体，为延长试剂的有效期，拟添加相应的稳定剂，如：

明胶、甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸盐、多聚精氨酸，脱脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性杂蛋白。

B表面活性剂

表面活性剂具有固定的亲水亲油基团，起到增溶、分散和防腐等作用。

常用的表面活性剂有吐温20（Tween）、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP，经实验筛选后选择最佳表面活性剂。

C防腐剂

常用的防腐剂有叠氮钠、柳硫汞、ProClin300和山梨醇，经实验筛选最有利于维持试剂稳定性的防腐剂。

D金属螯合剂

某些金属螯合剂，具有螯合金属的能力，可保护试剂中抗原、抗体的稳定性，如EDTA、DTPA、NTA。

10主要原料的选择

材料名称

价格/规格

易获得性

生产厂家

Anti-PCT单克隆抗体（一抗②）

1000元/mg

长期供应

博雅享达

Anti-PCT单克隆抗体—标记抗体

1000元/mg

长期供应

抗标记抗体的单抗（二抗）

1000元/mg

长期供应

ODs

4300元/mg

长期供应

深圳海王英特龙

11提高稳定性措施

试剂在2℃~8℃条件下，干燥、避光、密封贮存，有效期24个月，机内稳定28天。

校准品用去离子水复溶后2~8℃稳定100天。

固相、标记试剂为含具有生物活性抗体的液体试剂，为维持抗体的活性及试剂的稳定性，添加以下物质：

A.稳定剂

固相试剂和标记试剂中均含有抗体，为延长试剂的有效期，拟添加相应的稳定剂，如：

明胶、甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸盐、多聚精氨酸，脱脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性杂蛋白。

。

B．添加表面活性剂

表面活性剂具有固定的亲水亲油基团，起到增溶、分散和防腐等作用。

常用的表面活性剂有吐温20（Tween）、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP，经实验筛选后选择最佳表面活性剂。

C．添加防腐剂

常用的防腐剂有叠氮钠、柳硫汞、ProClin300和山梨醇，经实验筛选最有利于维持试剂稳定性的防腐剂。

D.金属螯合剂

某些金属螯合剂，具有螯合金属的能力，可保护试剂中抗原、抗体的稳定性，如EDTA、DTPA、NTA。

12抗干扰、特异性研究

三酰甘油（TG），蛋白质,PCT在体内的半衰期为4-6h半衰期较短,EDC/NHS有可能产生一定抗体聚合物，对本品有干扰，可以进行干扰试验。

13技术要求

根据罗氏说明书编制

项目

指标

特异性

≥99.0%

灵敏度

≥99.0%

抗干扰

三酰甘油<1.7mmol/L

精密度

阳性质控批内精密度：

CV≤15.0%

稳定性

试剂有效期24个月，开封后有效期均为100小时；

14溯源：

15生产过程控制：

（1）生产用水要用电导率<0.5μs/cm的纯水。

（2）试剂存放：

试剂要存放在高密度聚乙烯塑料容器中。

（3）抗体忌反复冻融

（4）要严格控制试验中的温度，湿度以及PH。

参考专利、文献：

专利：

1、CN0A一种降钙素原乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒

2、CN2A基于量子点荧光检测的酶芯片及其制备方法和应用

3、CN1A降钙素原和C反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法

4、CN3A一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法

5、CN6A一种基于荧光量子点检测炭疽芽孢杆菌的方法

6、CN1APCT/CRP联合检测用胶体金试纸条及其制备方法

文献：

[1]宋健,范佳,宋大千,毕丽荣,周广宇,张皓,魏景艳,杨柏.量子点偶联抗体型夹心免疫传感法检测心肌肌钙蛋白I[J].高等学校化学学报,2009,10:

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[2]郑怡麟,何莹,陈安,易维京,胡川闽.抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用[J].第三军医大学学报,2013,06:

523-526.

[3]张鹏飞,宋杰,陈佳,陆慧琦,韩焕兴.量子点与抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体的偶联研究[J].分析化学,2013,06:

846-850.

[4]邢仕歌,熊齐荣,钟强,张悦,卞素敏,金涌,储晓刚.量子点抗体偶联技术研究进展[J].分析化学,2013,06:

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[5]马慧莲.发光CdTe量子点生物偶联产物制备、性质及应用研究[D].东北大学,2005.

[6]白亚龙.一种基于量子点荧光微球的高灵敏度免疫层析技术初步研究[D].上海师范大学,2010.

[7]谢颖,徐静娟,于俊生,陈洪渊.水溶性的CdSe/ZnS纳米微粒的合成及表征[J].无机化学学报,2004,06:

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[8]邱婷,彭洪亮,何治柯.水溶性量子点CdSe/ZnS与蛋白质非特异性相互作用研究[J].化学传感器,2007,02:

26-30.

[9]胡晓武,李之珍,田雪,刘辉宇.胶体金法测定降钙素原试剂盒的研究[J].中华全科医学,2014,02:

271-273.

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