非编码RNA研究技术总结讲解学习.docx

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非编码RNA研究技术总结讲解学习

非编码RNA研究技术总结

非编码RNA研究技术总结

长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）是一类长度＞200bp的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ转录，lncRNA具有保守的二级结构,大部分不编码蛋白质。

LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。

主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。

非编码RNA可火了，miRNA大火烧了十几年，现在慢慢地把lncRNA的领域也给点着了。

现在可能连实验室的插枪头阿姨都知道绝大多数的RNA分子并不翻译，这非编码RNA（noncodingRNA），包括miRNA、lncRNA等。

目前主要研究方向集中在非编码RNA及其相互结合的DNA、RNA、蛋白质等科学问题，而科学问题的解答依赖于实验技术的创新使用和革命。

IncRNA可以海陆空全面调控细胞功能，厉害了，其实主要指lncRNA，而miRNA、siRNA主要作用于mRNA层面，本文按非编码RNA的三个调控维度，就当前主要的实验技术简单介绍一下。

（一）DNA维度

1）作用的ncRNA类型：

lncRNA等

2）研究方法介绍有：

和DNA序列结合的调控目的无非是①阻止下游基因的转录②把转录因子、甲基化酶等招惹过来修饰DNA序列。

他们的共同特点是和解链的DNA的某一条链结合，那么研究方法包括

1.RNA原位杂交（RNAinsituhybridization）

检测该ncRNA是否位于核内，如果不在核内，那就不用考虑和DNA作用了。

RNA原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。

原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

根据RNA序列设计cDNA、cRNA探针，对目标进行定位。

2.ChIRP（chromatinisolationbyRNApurifications）

是一项通过纯化RNA分子从而获得其结合的染色质片段（包括RNA结合蛋白与基因组DNA）的实验方法。

大概流程：

首先细胞交联，使lncRNA、染色质及被固定连接；随后通过超声将染色质打断，并使用带有生物素标记的tilingoligos与长链非编码RNA分子杂交；之后利用亲和素磁珠纯化长链非编码RNA及其结合的染色质片段；后续分析和测序。

3.ncRNA-DNA三联体的体外同位素检测

为了进一步检验这种调控机制和结合方式，可以在体外分别合成此ncRNA和DNA片段，并用同位素（P32）标记，在体外做结合实验，如果不结合，那么就会呈现两条已知的条带，如果能够结合，那么就会有一条RNA-DNA分子量新条带出现。

（二）RNA维度

1）作用的ncRNA类型：

mRNA-miRNA-lncRNA+circRNA等

2）研究方法

既然是RNA-RNA相互作用，除了胞内FISH定位技术以外，还有其他技术要使用，如下

1.CLASH（crosslinking-ligationandsequencingofhybrids）

对RNA分子与RNA分子相互作用进行研究的实验系统，主要被用于鉴定miRNA与其靶mRNA的相互作用。

大概流程为：

首先对细胞进行交联处理，将miRNA及其靶mRNA与RISC复合物固定连接；随后通过Co-IP富集纯化RISC复合物；之后再通过分子内连接将miRNA的3'-OH末端与靶mRNA的5'-PO4末端连接，形成一条长的单链RNA，然后测序。

2.CHART（CaptureHybridizationAnalysisofRNATargets）

也可以叫做RNAprecipitation，根据ncRNA序列设计探针，二次探针交联在固相载体上，若将核内RNA-DNA状态固定处理，染色质超声打碎成小片段，RNA-DNA的结构就可以被探针抓取下来，利用DNA-Seq对抓取的DNA进行测序，获得DNA结合序列的信息（不过这个可以被生信分析工具所预测一下）。

3.荧光素酶报告系统

在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区的下游插入ncRNA结合序列或者mRNA的3’UTR区，然后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRNA或者mRNA的3’UTR区中是否含有miRNA的靶位点。

同理任意两种RNA-RNA互作都可以利用这个原理。

（三）蛋白质维度

1）作用的ncRNA类型：

lncRNA、mRNA较多

2）研究方法：

这种互作模式是RNA-Protein，那么ncRNA可以和调控DNA的蛋白结合，也可以和细胞质内的蛋白质结合，发挥不同效应。

1.CLIP-seq：

鉴定与特定RNA结合蛋白相互作用的RNA分子

CLIP-seq也被称为HITS-CLIP，是将紫外交联免疫共沉淀技术（CLIP）与高通量测序技术相结合的技术。

大概流程为：

首先通过紫外照射将细胞内的RNA分子与RNA结合蛋白进行耦联；细胞裂解，免疫共沉淀，核酸酶（RNase）将共沉淀的RNA切割，只保留蛋白质内部的RNA片段；通过5'末端放射性标记RNA分子及SDS-PAGE电泳，选择性地回收目的蛋白结合的RNA片段；最后高通量测序。

其可以衍生了许多变异的CLIP-seq方法，例如增强了交联强度的PAR-CLIP和能够精确鉴定RNA分子中蛋白质结合位点的iCLIP等。

2.mRNA-蛋白研究方法：

利用Poly（A）尾

首先紫外交联（UV-CL），将mRNA与蛋白质的相互作用固定连接；随后使用耦联磁珠的Oligo（dT）富集纯化mRNA蛋白复合物，经过洗涤及降解RNA等步骤，最后将获得的蛋白质进行质谱分析。

3.EMSA

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。

RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。

4.RIP（RNA-immunoprecipitation）

RNA免疫沉淀可以用来研究组织或活细胞中蛋白质和RNA之间的相互作用。

该方法的原理是采用针对目标蛋白的抗体,把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化,并对复合物上的RNA进行分析鉴定。

RIP技术分别与Chip和RNA-Seq相结合而衍生的RIP-Chip和RIP-Seq技术,也广泛应用于lncRNA与蛋白质的相互作用中。