PCR扩增产物的分析方法.docx

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PCR扩增产物的分析方法

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PCR扩增产物的分析方法

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PCR扩增产物的分析方法

微孔板夹心杂交法

颜色互补分析法

PCR-ELISA法

PCR-OLA法

PCR-打点杂交法

微孔板夹心杂交法：

该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次杂交，漂洗后显色即可判断结果。

该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。

该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。

此法的敏感性和特异性与PCR32P探针的Southern杂交法相当。

但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。

另一种微孔板杂交法不是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物杂交。

微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点：

①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封闭过程。

另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。

微孔板杂交的基本过程包括L：

DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。

DNA的固定

在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。

不同来源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。

因此，必须用一系列的盐浓度（0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交。

显色后，判断合适的固定盐浓度。

固定方法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。

用合适浓度的NaCl或（NH4）2SO4可达到此目的。

硫氰酸钠则无固定作用。

盐浓度合适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。

Mg2+虽有促进DNA固定的作用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。

被固定的DNA应大于300bp，否则影响杂交结果。

每孔可固定高达200ng（624bp）的DNA。

合适的盐浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。

待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。

与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。

固定液：

10mmol/L磷酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后，终浓度为最适固定浓度）。

用胶布封好，浸于37℃水浴2h。

用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。

立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。

杂交

可采用标准的杂交系统杂交。

夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检测探针一并加。

杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。

显色

根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波长。

颜色互补分析法（A）

颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明）。

如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）。

如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带。

如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色-黄色带。

如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。

此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补的黄色条带。

该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。

这种情况下，只需判断产物的有无。

另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合PCR。

此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM等）。

PCR-ELISA法：

（A）

本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。

因为5’端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。

链霉亲和素的包被：

不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。

亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%（w/v）Tween20，Ph7.2配成1μg/ml。

向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。

用PBS液漂洗。

扩增产物与包被板的结合：

PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。

室温下作用30min。

用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。

　　ELISA：

向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用30min。

用PBS-Tween漂洗6次。

将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍，向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。

于ELISA计数仪上450nm测定OD值。

另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。

PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。

需注意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。

PCR-OLA法（A）

研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位置。

已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。

所以，一般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。

寡核苷酸连接试验（OLA）就是为此目的而设计的。

它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序列。

OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。

寡核酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。

连接后，通过固相化的亲和配基使其固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。

这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。

此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连接反应，则称之为连接酶链反应。

两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。

另外，连接酶所形成的键是连接产物。

该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋白酶初步处理有核细胞作为检测样品。

需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为例的。

如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更易于自动化。

寡核苷酸的设计与标记：

用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。

即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。

左侧寡核苷酸是5’标记生物素。

右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的3’-OH相连接。

用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素等）。

OLA反应：

向一软质圆底微滴定板内依次加入：

3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA（10μg/μl）;1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。

加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。

加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连接（约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释）。

5X连接缓冲液：

250mmol/LTris-HCl，Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。

不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。

混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。

加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。

加入1μl1mol/LHCl中和。

加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用10min。

将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。

再用数毫升1%SDS和0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。

取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。

打点杂交

当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。

这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记的探针杂交。

点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。

放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。

但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验。

因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。

非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度快。

因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。

膜的制备：

点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每一个探针制备1张膜。

然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的PCR产物作探针去杂交。

这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列变异的种类。

显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后一方法仅需一次杂交即可判断结果。

产物的固定：

⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的大小裁剪膜，并做好标记。

⑵将膜浸入水中湿透至少1min。

⑶变性PCR产物：

此步可在圆底微孔板或微量离心管内操作。

每点的变性方法为；5～20μl（50～100ng）PCR产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT）混匀，室温作用5min即可。

⑷小心将预湿的膜装在点样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。

因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融合。

膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。

⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲液，真空抽滤“洗涤”样品。

⑹取下膜，置于厚3mm滤纸上渍干。

重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。

⑺渍干的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2的强度下照射使DNA固定在膜上。

此时，的膜可直接用于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。

探针的固定：

因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较困难，即使固定上，也会影响杂交。

这就是需要将寡核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固定。

因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。

这种加尾固定的探针不影响杂交。

但这种杂交对固定探针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特异的。

通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变探针的固定可达到特异性的要求。

这种固定的探针可用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生物。

（1）加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端，在四种脱氧核苷中，以dT加尾效果最好。

通过改变dT浓度和TdT量可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达400个dT。

①向一微量离心管中依次加入：

寡核苷酸探针，100～200pmol;10×TdT缓冲液（1mol/L二甲胂酸钾;250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT）10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。

②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。

③加入100μl10mmol/LEDTA终止反应。

加尾长度可通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳监测。

（2）点膜：

①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。

②加入等体积6×SSC（1×SSC:

0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三钠pH7.0）。

③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或hybond-N固定在点样器上。

④点样方法同上。

（3）固定：

①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6滤纸上，DNA面朝上。

②将滤纸和膜一起置于254nmUV灯下照射固定，poly（dT）400尾的探针在40mJ/cm2r的剂下固定效果最好。

辐射剂与给定光源对给定面积的能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。

一般对一个固定光源而言，辐照剂量为：

辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间（s）

其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。

辐照度与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正相关。

③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃漂洗30min左右。

漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室温保存。

探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。

如用poly（dT）400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol）杂交，固定6pmol苷酸杂交时，有29.2%的PCR产物与1.1%的寡核而固定的探针600fmol杂交时，仅有2.2%的产物与0.8%。

用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明，poly（dT）300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly（dT）400时，则与产物杂交。

因此，固定的探针加最好在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。

杂交

寡核苷酸探针的杂交：

每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂洗条件，主要取决于探针的Tm值。

Tm值则受探针长度，G+C含量和杂交液的盐渡影响。

一般要由如下公式：

Tm=4（G+C）+2（A+T）来计算Tm值。

在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。

提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。

漂洗液一般不含盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。

一旦确定了探针的杂交与漂洗条件，可按下述方法进行杂交。

⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：

;200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。

⑵置膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液，0.5%TritonX-100），封口。

袋内不要有气泡。

⑶置于水浴加热摇动，在杂交温度下预杂交5min。

⑷取出塑料袋，剪开一角。

加入非放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。

每毫升杂交中加入1pmol探针。

封口后摇育20～60min。

杂交时间不能太长，否则会引起探针与膜的不可逆结合。

⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液（SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。

⑹漂洗温度下预热的漂洗液在合适温度下洗10min。

漂洗后的膜可用于显色检测。

反向点杂交：

反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上的寡核苷酸杂交。

如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。

为此，主要是认真选择与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。

在同一杂交特异。

一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度杂交。

只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。

杂交时间（2～4h）要长些。

PCR产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。

杂交的检测

不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。

若为酶标探针则可直接进行显色检测。

下面以生物素标记物为例加以说明。

酶标亲和素的结合　⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100）中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振荡。

⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。

显色　不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说明。

⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作用5min，并轻轻振荡。

⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。

此步应避强光。

缓冲液D：

1份底物（TMB：

2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。

⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。

应避强光。

缓冲液E：

2000份缓冲液D和1份3%H2O2。

显色时间取决于杂交体中含标记物的量；一般为1～15min即可。

杂交阳性呈深蓝紫色。

⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程中应更换2～3次液体。

⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。

膜的再利用　⑴脱色：

将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。

⑵去杂交的探针：

将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。

⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。

问题与对策

信号弱：

①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。

本底信号强：

①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长-缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④显色时间长-缩短显色时间。

杂交膜的高本底着色：

①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。

阴性对照出现阳性信号：

①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂重复全部扩增反应。

（我自己加进的：

Hybond—N+：

Hybond-N+是带正电尼龙膜，对在碱性条件下杂交和普通的Southern杂交均有很好的灵敏性，故核酸样品可通过简单的碱处理固定在膜上，而不必在紫外灯下固定，尽管紫外固定的重复性最好。

）