凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒.docx

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凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒

凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（通用）

（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本）

使用说明书

一、TUNEL制品说明

凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

本试剂盒特点

●操作简便：

使用Ready-to-Use型试剂，并配有ProteinaseK和DAB。

●高灵敏度：

可以单一检出初期的凋亡细胞。

●高特异性：

能特异性染色凋亡细胞。

●快速操作：

整体操作约需3小时。

●用途广泛：

可应用于组织切片、细胞样本等。

●方便观察：

使用光学显微镜观察实验结果。

●高正确性：

有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性

使用注意事项

1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。

2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。

3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。

4．TdT酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。

5.为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

6.固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。

7.使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。

8.进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

9.DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10mg/ml）后，按说明书显色使用。

二、TUNEL试剂盒组分

组份

Cat:

KGA702

20assays

Cat:

KGA703

50assays

Cat:

KGA704

100assays

储存条件

EquilibrationBuffer

1.0mL

2.5mL

5.0mL

-20℃

Biotin-11-dUTP

20μL

50μL

100μL

-20℃

TdTEnzyme

80μL

200μL

400μL

-20℃

50×ProteinaseK

40μL

100μL

200μL

-20℃

Streptavidin-HRP

10μL

25μL

50μL

4℃避光

DAB

2mg

5mg

10mg

-20℃

试剂盒以外自备仪器和试剂

光学显微镜、37℃孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。

二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：

苏木素或甲基绿等。

三、操作流程概览

四、检测样本的预处理

TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。

1．细胞样本的准备

操作注意事项：

1.为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

2.使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。

3.进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

4.固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。

五、标记和显色反应

操作注意事项：

1.进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应

3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4.TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。

不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

6.苏木素复染：

将切片放入苏木素染液，染色30s-10min（根据样本做适当调整），蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。

分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5分钟。

用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。

晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。

六常见问题的原因及推荐解决方案

现象

可能原因

建议

非特异性染色（例如：

非凋亡细胞的强染色）

Biotin-dUTP的非特异性结合

勿使细胞干涸

在TdT酶反应之后，再用含0.1%TritonX-100和1mg/mlBSA的PBS洗三次。

TdT酶的浓度过高

用TdTdilutionbuffer*作1：

2——1：

10稀释，

内源过氧化物酶未被封闭

封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液：

3%H2O2溶于甲醇）

光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：

甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）

尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂

在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用）

确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定

固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂

用含有dUTP和dAPT的溶液封闭

染色背景较高

福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色

尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。

内源过氧化物酶未被封闭

封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液：

3%H2O2溶于甲醇）

Biotin-dUTP的非特异性结合

在TdT酶反应之后，再用含0.1%TritonX-100和1mg/mlBSA的PBS洗三次。

样本被支原体污染

使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本

标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高

稀释50%，以降低标记反应的浓度

细胞处于高度增殖期

在非高增殖期取样检测

DAB孵育时间过长

减少DAB染色时间

标记率低、染色淡至无

如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）

用溶于PBSPH7.4中的4%多聚甲醛固定

或福尔马林或戊二醛固定。

过度的固定导致与蛋白过度交联

缩短固定时间，或用溶于PBSPH7.4的2%多聚甲醛固定

促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低

●      增加通透剂促渗时间

●      增加通透剂的作用温度（15-25℃）

●      优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：

以400ug/ml作用5min）

●      0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。

复染信号较弱

选择的染料不合适

用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿PH4.0，或苏木素复染

阳性对照没有信号

DNaseI的浓度过低

●        冷冻切片使用3U/mL的DNaseI

●        石蜡切片使用1500U/mL的DNaseI

●        一般样本使用10U/mlDNaseI

●        反应缓冲液：

10mMTris-HCl（PH7.9），10mMNaCl,5mMMnCl2,10mMCaCl2，25mMKCl2，37℃反应30min，PBS洗去。

组织样本从载玻片脱落

组织样本被酶从玻片消化下来

降低蛋白酶K的处理时间

*TdTdilutionbuffer：

60mMKPB缓冲液（pH7.2），150mMKCl，1mM2-mercaptoethanol，50%Glycerol

非离子表面活性剂

TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚）免疫细胞化学中，TritonX-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的TritonX-100储备液，临用时稀释至所需浓度。

30%TritonX-100的配制：

试剂：

TritonX-10028.2ml

0.1mol/LPBS（pH7.3）或0.05mol/lTBS（pH7.4）72.8ml

配制方法：

取TritonX-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。

用前取该储备液稀释至所需浓度。

TritonX-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。

它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。

1%的TritonX-100常用于漂洗组织标本，0.3%的TritonX-100则常用于稀释血清，配制BSA等。