终稿基因B在肿瘤组织中过表达原因分析.docx

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终稿基因B在肿瘤组织中过表达原因分析

化学生物学课程设计

基因B高表达原因分析

专业：

化学生物学

学生姓名：

方晟，杜正宾，房蕾，

王芳琴，尹先珍

指导教师：

马亮，刘姿

时间：

2015年1月10日

目录

第一部分：

背景介绍（方晟）1

第二部分：

实验思路与计划（方晟）2

1、实验思路2

二、实验计划3

第三部分：

相关实验方法5

一、表达载体相关方法（杜正宾）5

二、RNA干扰技术（房蕾）13

三、启动子与转录因子分析（王芳琴）17

四、免疫组化（尹先珍）33

五、表观遗传（尹先珍）41

附：

排版：

方晟

第一部分：

背景介绍（方晟）

世界卫生组织2月3日发表的《全球癌症报告2014》中称2012年中国新增癌症病例高居第一位，中国虽然发病率低于发达国家，但是新增和死亡病例居世界第一，男性易发肺癌和肝癌，乳腺癌在全球女性中成最高发癌症，2012年新增癌症病例有近一半来之亚洲，其中大部分在中国。

肺、肝、食道、胃等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。

因此，癌症治疗形势刻不容缓。

现阶段，癌症主要治疗方式以外科切除手术、放射线治疗和化学治疗为主，但严重的副作用使得病人在治疗过程中极其痛苦。

因此，寻求癌症的治疗手段，开发治疗癌症的药物，已经成为21世界最具有前景和潜力的研究方向，以基因为主轴的治疗方式，研发特异性靶向癌细胞的基因药物已经成为开发治疗癌症药物的主流。

所谓靶向治疗，是指以标准化的生物标记物来识别是否存在某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因或基因谱，以此确定针对特异性靶点的治疗方法。

是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。

癌症是复杂的多基因疾病，研究癌症发病机制、寻找癌症相关蛋白异常表达、开发针对特定癌症相关靶蛋白的药物开发，已成为目前抗癌药物设计与研究的重要方向。

通过比较肿瘤组织和正常组织中基因B表达量发现，基因B在肿瘤组织中特异性高表达，而在正常组织中表达水平低，可能基因B高表达与癌症发生相关，也可能成为治疗癌症的靶点。

本课题是研究肿瘤组织中某基因B的过表达原因，想以此阐述基因B与癌症之间相关关系，为研发靶向该基因B相关通路蛋白的抗癌药物提供研究思路和方向。

第二部分：

研究思路与计划（方晟）

基因表达调控是维持细胞正常活动的基础，中心法则告诉我们，DNA可以经转录成RNA，RNA翻译后形成蛋白质，蛋白质作为生命活动主要承担者，进行新陈代谢、维持细胞形态等生命活动。

为研究某基因在肿瘤组织中高表达原因，就必须首先要弄清基因表达的过程和调节过程。

下图展示基因表达调控的不同层次。

然后可以根据不同层次的研究，来探索基因B究竟在何水平调节下高表达。

图1不同水平上的基因表达调控

一、本课程设计思路

本课程设计主要是在转录水平探索基因B过表达原因

1.基因B在其相关信号网络中分析

基因B上下游基因与基因B相关关系研究（设定上游基因为基因C，下游基因为基因D）

1.1查找文献，是否有基因B与上下游基因C或D相关关系研究

1.2基因C或D高表达

所使用方法：

表达载体构建

检测指标：

基因B、基因C或D表达蛋白量

1.3基因C或D敲出或沉默

所使用方法：

RNAi技术

检测指标：

基因B、基因C或D表达蛋白量

若出现阳性结果，则进一步研究肿瘤组织中基因C或D的相关表达量和调控。

方法和本课题相关方法一致，是重复研究，直到最终确证原因。

2.基因B相关转录因子分析

寻找基因B相关转录因子，基因B与相关转录因子关系研究

　2.1查找文献，是否有基因B与其相关转录因子关系研究

　　　　　2.2基因B启动子分析

所使用方法：

启动子分析软件

目的：

寻找基因B相关可能转录因子

2.3基因B相关可能转录因子验证

所使用方法：

同1.2和1.3.即高表达或者沉默基因B相关可能转录因子，所使用手段与1.2、1.3相同

需要研究相关可能转录因子是否在该肿瘤组织中高表达。

3.其他分析

RNA剪接，RNA稳定性研究，翻译因子调控，蛋白活性调节，蛋白质稳定性和降解机制，表观遗传等

图2研究思路分析

2、实验计划

L1进行基因B相关生物信息学分析，分析其在肿瘤基因组中的位置，序列上下游信息等

目的：

为后期实验做准备。

L2检测基因B在正常组织和肿瘤组织的mRNA表达含量

方法：

RT-PCR，NorthernBlot等

目的：

该实验验证区分基因B表达究竟是转录前，转录水平还是转录后，翻译，翻译后水平上的调节

结果预测：

若正常组织和肿瘤组织基因B的mRNA水平抑制，那么就说明可能不是转录调控相关的调控，反之，肿瘤组织基因BmRNA水平高，那么说明在转录前或者转录调控过程中，该基因B在肿瘤组织与正常组织中不同，可能其高表达与转录调控有关。

L3构建基因C或D的表达载体，细胞转染到肿瘤细胞中，培养后检测基因C或D，基因B的表达产物含量

方法：

表达载体构建和细胞转染转化相关实验，NorthernBlot，WesternBlot等

目的：

高表达基因B上下游基因，看基因B表达量，看上下游信号与基因B是否有相关。

结果预测：

与对照组比较，若基因B高表达，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。

L4设计并构建基因C或D的shRNA的慢病毒载体，细胞转染，利用WesternBlot检测shRNA功能，而后，选取最佳设计的shRNA的慢病毒载体，转染到肿瘤细胞中，培养后，检测基因C或D，基因B的表达产物含量

方法：

RNAi技术相关实验，慢病毒载体构建，细胞转染，NorthernBlot，WesternBlot等

目的：

基因沉默基因B上下游基因，看基因B表达量，看上下游信号与基因B是否有相关。

结果预测：

与对照组比较，若基因B表达水平相对低，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。

L5基因B启动子分析与软件预测转录因子，而后，查找预测的转录因子是否在该肿瘤组织中高表达，而后，选出备选方案，将备选的转录因子利用与L4类似的步骤进行RNAi干扰沉默，随后检测备选转录因子含量，基因B表达产物含量

方法：

启动子分析预测软件，RNAi技术相关实验，细胞转染，NorthernBlot，WesternBlot等

目的：

寻找基因B的转录因子并验证。

结果预测：

若沉默该转录因子后，基因B表达水平相对变低，那么，测说明可能该转录因子与基因B表达相关。

反之，则可能无关。

若全部筛选完转录因子后都是基因B表达水平和肿瘤组织中差不多，那么，可能与转录因子无关。

L6启动子与转录因子相关性能分析

方法：

酵母双杂交技术，电泳迁移实验，WesternBlot等

目的：

检测与目标转录因子结合的蛋白的

结果预测：

可通过上述的wensternblot等方法检测与目标转录因子结合的蛋白的表达量，若高表达则可能是转录激活因子，若低表达则可能是转录抑制因子。

而后可以进一步分析转录因子相关的信号通路啦。

不断验证。

以下可能做，

L7表观遗传相关实验

目的：

探究基因B在肿瘤组织中，是否通过表观遗传方式激活。

若L2结果为阴性，为选出后续可能在转录后水平或翻译水平，翻译后水平，可能进行的实验

L8基因B转录组测序与基因组测序，以及进行比对。

目的：

比对分析，为后续实验指导相关信息

L9基因B表达产物蛋白的免疫沉淀实验

目的：

筛选出与基因B相互作用蛋白，以此来分析蛋白活性调节与是否与蛋白降解相关

还有很多其它方法，时间有限，这里就不例举说明了。

其实整个基因B高表达相关的调节机制有很多，可能是基因B表达来路上调，也可能是基因B表达产物去路阻滞。

统计分析

根据每个实验，设置对照组和空白组，平行实验3次，计算R值，R小于0.05才具有统计学意义。

第三部分：

相关实验方法

1、表达载体相关方法（杜正宾）

1.引物设计：

引物设计 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

1.1引物设计原则

1.1.1长度：

15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74度），从而降低产物的特异性。

1.1.2G十c含量：

应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。

引物长度小于20时，其Tm恒等于4×（G十C）十2×（A十T）。

1.1.3碱基分布的随机性：

应避免连续出现4个以上的单一碱基。

尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。

1.1.4引物自身：

不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

1.1.5引物之间：

两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

1.1.6上下游引物的互补性：

一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

1.1.73’末端：

如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

1.1.8引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

1.2.引物设计软件：

  软件的引物设计功能主要体现在两个方面：

首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。

自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、“DNAsis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。

要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。

引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。

1.2.1PrimerPremier5.0

  “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA基元（motif）查找。

“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。

此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。

1.2.2Oligo6.22 

 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。

它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。

Oligo5.0的初始界面是两个图：

Tm图和ΔG图；Oligo6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。

“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。

但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

2.PCR：

PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

2.1标准的PCR过程分为三步：

DNA变性

（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

退火

（60℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸

（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

如图所示：

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

检测

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。

荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。

电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。

但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

2.2PCR反应体系

10×扩增缓冲液10μl

4种dNTP混合物（终浓度）各100～250μmol/L

引物（终浓度）各5～20μmol/L

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶5～10U

Mg2+（终浓度）1～3mmol/L

补加双蒸水100μl

其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。

3RT-PCR：

RT-PCR为逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

3.1RT-PCR技术相关试剂

oligo:

多聚体，相当于mRNA引物

AMVRT：

禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

MMLVRT：

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶

dNTPs：

脱氧核苷酸

RNase：

RNA水解酶

PCRBuffer：

RT-PCR缓冲液

MgCl2：

2价镁离子

2.2操作步骤编辑

RT-PCR反应原理

2.2.1.总RNA的提取：

见相关内容。

2.2.2.cDNA第一链的合成：

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例：

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。

在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列试剂的混合物：

10×PCRbuffer2μl

25mMMgCl22μl

10mMdNTPmix1μl

0.1MDTT2μl

轻轻混匀，离心。

42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加热15min以终止反应。

（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。

-20℃保存备用。

2.2.3．PCR：

（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：

第一链cDNA2μl

上游引物（10pM）2μl

下游引物（10pM）2μl

dNTP（2mM）4μl

10×PCRbuffer5μl

Taq酶（2u/μl）1μl

（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。

轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。

在适当的温度参数下扩增28-32个循环。

为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定：

行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5）密度扫描、结果分析：

采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

2.3注意事项

2.3.1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2.3.2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

2.3.3．内参的设定：

主要为了用于靶RNA的定量。

常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

2.3.4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

2.3.5．防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

3.电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定.聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。

其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出10-9～10-12g的样品，且重复性好，没有电渗作用.

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量.其原理是带大量

电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（1～100μg），但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确.

聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。

电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果.凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。

琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度；②分析蛋白质混合物的组分；③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相同.

核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。

3.1琼脂糖凝胶电泳

3.1.1.原理　琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。

将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。

将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。

在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

3.1.2琼脂糖凝胶电泳的仪器及试剂　仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。

同时配备紫外线检测仪和照相系统。

试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。

电泳缓冲液常用TBE（1000ml中含5.4gTris，2.75g硼酸，2ml0.5mol/LEDTA，pH8.0）。

溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，它可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移，将凝胶置紫外光下，插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移。

EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。

由于EB是一种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。

常用的凝胶加样缓冲液有4种，见表2-28：

表1　凝胶加样缓冲液

缓冲液类型

6×缓冲液

贮存温度

Ⅰ

0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青40%（W/V）蔗糖水溶液

4℃

Ⅱ

0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青15%（W/V）聚蔗糖水溶液

室温

Ⅲ

0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青30%（W/V）甘油水溶液

4℃

Ⅳ

40%（W/V）蔗糖水溶液

4℃

3.1.3凝胶的制备和电泳

操作方法如下：

（1）用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的塑料盘的边缘圈封，制成胶模，置水平工作台上；

（2）称取适量琼脂糖，置电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；

（3）待溶液冷至60℃，加入10mg/mlEB贮存液，使终浓度达0.5mg/ml；

（4）在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡；

（5）凝胶完全凝固后，移去梳子和透明胶，将凝胶放入电泳槽。

加入TBE缓冲液使恰好没过胶面约1mm；

（6）将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；

（7）接通电源，使样品槽在负极端，用1-5v/cm的电压，电泳适当时间；

（8）电泳结束后，可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察，并拍照记录，也可将不含EB的凝胶在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分钟，再如上观察和拍照，记录结果。

3.1.4.凝胶摄影

需配置135照相机，全色135胶卷，照相机固定架，近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。

操作需在暗室进行，将相机固定好，把凝胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。

亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。

3.1.5.EB溶液的净化处理

由于EB具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。

（1）对于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下处理：

①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5μg/ml；

②加入一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再加入等量的25mol/LHCl，混匀，置室温数小时；

③加入一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀并废弃。

（2）EB含量小于0.5μg/ml的溶液可如下处理：

①按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；

②用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。

4.酶切连接

4.1实验方法原理：

限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

4.2实验材料：

标准pUC19（2686bp）

试剂、试剂盒：

EcoRI及其配套的酶切缓冲液0.5×TBE电泳缓冲液6×LoadingBufferGoldview琼脂糖

仪器、耗材：

水平电泳仪水浴锅移液器微波炉成像设备

4.3实验步骤

4.3.1.在200ul的离心管中，按照下表加入试剂（单位：

ul），混匀；点动离心将反应液甩至管底。

37℃保温2h进行酶切反应。

4.3.2.反应结束后，加入2ul 10×LoadingBuffer钝化酶活性；（或：

65℃，保温20min使酶失活）。

4.3.3.电泳检测。

酶切阴性对照：

pUC19标样+10×LoadingBuffer2ul

酶切样品：

标准pUC19酶切样品10ul+10×LoadingBuffer2ul

4.4注意事项

影响酶切的因素：

在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。

但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切。

5.感受态细胞

感受态细胞（competentcell）：

理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和