HIV实验室指南全解VOLAB 实验室建设指南.docx

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HIV实验室指南全解VOLAB实验室建设指南

HIV实验室指南全解_VOLAB实验室建设指南

HIV实验室指南全解_VOLAB 实验室建设指南

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）及其相关标志的检测是预防HIV感染和艾滋病临床治疗中重要的环节，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的诊断、HIV感染的诊断、血源及器官供体的筛选、流行病学调查、艾滋病病人及HIV感染者的病情动态观察、临床治疗疗效考核以及HIV疫苗的安全性和效果鉴定等。

HIV感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。

病毒标志是指直接从HIV感染者体内分离出病毒或检出HIV组成成分（抗原或核酸）。

免疫标志是指HIV感染所产生的HIV抗原、抗体等免疫物质。

相关标志是指HIV感染后与艾滋病病情进展有密切关系的某些标志，如CD4细胞、CD8细胞，β2微球蛋白、有关细胞因子等。

这些标志的测定可为HIV感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。

目前HIV抗体的检测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且持续时间最长的免疫学标志，而且抗体的检测方法大多简便、经济，易于推广应用。

在介绍各种HIV实验室诊断方法之前，为了使实验室工作人员能够有效地确保结果准确、可靠、优质，我们必须对作为一种感染因子的HIV以及由它所导致的致命性危害有基本的认识。

实验室工作人员应特别注意病毒的结构、抗原组成，人体的免疫反应，诊断试验的基本原理、试验结果的解释，以及为了准确而有效地提供实验诊断所必需的质量保证措施。

如果由于缺乏技术专长或基本知识而造成不正确的试验结果是不可原谅的。

现将有关内容扼要介绍如下：

一、人类免疫缺陷病毒（HIV）概述：

（一） 艾滋病病原体的发现和命名：

（二）HIV病毒的形态结构、分类和分型

HIV病毒是带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属于逆转录病毒科中的慢病毒亚科。

目前发现有HIV-1和HIV-2两型。

现已将HIV-1分为M组，共10个亚型（A-J）和O组，HIV-2也至少有6个亚型（A-F）。

在我国流行的是HIV-1，检测到的亚型有8种之多，其中B亚型几乎见于我国各个地区，而C亚型主要见于我国西南和西北地区，E亚型则多见于东南沿海和西南边境地区。

HIV病毒呈球形或卵圆形颗粒，直径100-140mm，具有包膜。

包膜是在病毒出芽释放过程中获得的。

从脂质膜上延伸出来的刺和园头是糖蛋白（gp）。

病毒颗粒内部为核心，具有蛋白质衣壳，里面有两个相同拷贝的核酸（RNA）和病毒的三种酶：

逆转录酶（RT）、整合酶和蛋白酶。

HIV基因组（RNA）含有9个基因，可分为结构基因和调节基因。

结构基因包括gag、pol和env3个，皆为调节基因。

（三）与诊断技术密切相关的HIV抗原

由三个结构基因编码的HIV-1抗原如下：

1、gag蛋白：

位于病毒颗粒内核心部位，主要有分子量为55000道尔顿的蛋白质（P），称P55。

P55抗原是前体蛋白，在感染过程的早期产生，尔后裂解成其他核蛋白，包括P24、P17和P15等。

2、env（包膜）糖蛋白：

包膜抗原皆为糖蛋白（gp），根据分子量分别称为gp160、gp120和gp41。

gp160是前体蛋白，是在感染过程中产生的一种成份，随后裂解成gp120和gp41。

gp120是外膜蛋白，组成外膜的72个刺突和园头。

gp41为跨膜蛋白。

二者共同参与病毒与突主细胞CD4分子的粘附。

3、pol（聚合酶）蛋白质：

包括P66（RT）、P51和P31（整合酶或核酸内切酶）。

尽管HIV-1和HIV-2抗原之间有交叉，但它们也有各自的特异性抗原。

大多数交叉反应是由抗核心抗原的抗体所致，因为这二种不同病毒的gag抗原是非常保守的。

各自的这些特异性抗原在HIV-1和HIV-2是相似的，但分子量可略有不同。

例如，HIV-2的跨膜蛋白抗原称为gp36，而某些人则称之为gp41，又如主要的核心抗原为P24，但在HIV-2又称P26。

（四）HIV感染的生物学和免疫应答：

人体能对HIV的侵入产生抗体应答，通常是在HIV感染2-10周内机体产生抗体。

但也有极少数人感染数月乃至数年后仍测不出抗体，故阴性结果并不说明受检者绝无感染。

绝大多数人在感染过程中都会对各种病毒抗原成份产生免疫应答，抗体滴度可高达1：

50000，但也可以很低。

感染早期（血清阳转时）及病程后期（免疫缺陷）时，抗体滴度均较低。

大多数病毒感染者都有IgM抗体产生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM应答。

对于有IgM抗体应答者，在窗口期检出IgM抗体是有益的。

HIV基因组可整合到宿主细胞DNA上使机体终身带有病毒，但机体可能很多年不出现症状，成为HIV无症状感染者，只是查血时发现抗—HIV阳性。

尔后，在某些因素作用下，病毒被激活后并开始大量复制出现症状和各种合并症，则发展成艾滋病病人，HIV病毒很容易发生变异这是研制有效疫苗的主要困难之一。

二、HIV实验室诊断

人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。

几周后出现IgM抗体并很快消失，此后,IgG抗体出现并一直存在。

因此，HIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，病毒及相关抗原的检测为辅。

抗体检测分为初筛试验和确证试验两种，初筛试验为阳性的血清必须进一步确证，确证为阳性的方可报告为HIV感染阳性。

多聚酶链式反应（PCR）主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。

此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。

（一）标本收集

    HIV感染者血清标本的收集按常规方法进行，静脉抽血，不加抗凝剂。

标本在室温或4℃冰箱静置24小时，待血清析出后作抗体检测。

污染标本可短时间离心后取上清液作检测，但解释结果时应慎重。

用于检测HIV抗原的血液样本与检测抗体的样本的处理有所不同，根据需要，血液样本需进行核酸处理。

采用定量PCR方法检测病毒含量时，加入肝素的血浆，检测的RNA含量较未加肝素的血浆样本高。

检验人员应注意自身的防护，在未证实之前，所有的标本均应当作“阳性”标本看待。

（二）HIV抗体的初筛检测

初筛试验的要求是敏感性高，理论上要求达到100%，尽可能避免漏掉可能阳性的对象，相对来说，对特异性要求不是太严，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复试验和确证试验排除。

HIV抗体初筛检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）、明胶颗粒凝集实验（gelatine particle agglutination assay, PA）、乳胶凝集实验（latex agglutination assay, LA）、各种快速检测实验（rapid tests）、放射免疫实验（radio immunoassay）等。

这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，称为第一代试剂，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，为了获得可接受的特异性而稀释标本使试剂的敏感性也有所下降，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。

第二代试剂使用重组或合成多肽HIV抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备也更为安全、容易、重复性好。

应该注意的是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，多肽抗原由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阴性。

使用重组或合成多肽抗原制备的双抗原夹心法试剂盒常常被称为第三代试剂，这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同时不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。

第四代试剂除使用重组或合成多肽抗原外还包被了P24抗体，可同时检测抗原和抗体。

    1．酶联免疫吸附实验  酶联免疫吸附实验（ELISA）是最常见的HIV抗体检测方法，它具有准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批量标本的检测，是献血员筛选和临床诊断最常用的方法。

尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫测定方法在体外检测尿液中HIV－1抗体。

此法用于实验室辅助临床HIV感染诊断。

在确定标本HIV－1抗体的结果之前，根据美国疾病控制中心推荐的HIV抗体的诊断步骤，此项检测重复阳性的标本，用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western Blot试剂盒进行确诊。

近年与血液检查相比，尿液检查有多种优点。

在尿液中一般不存在HIV病毒。

卡里普特公司的剑桥生物HIV－1尿液Western Blot试剂盒，可对于尿液EIA重复阳性标本做确认实验。

尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重组的HIV－1表面抗原在尿液中检测HIV－1抗体。

微孔板的孔中包被gp160膜抗原。

把尿液标本或对照与标本缓冲液一起加入孔中温育。

如果标本中存在HIV－1膜抗原的抗体，它们将与孔中的抗原结合。

标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异性结合。

通过洗涤去除未结合的物质。

然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体并温育。

酶联物与孔中结合到抗原的HIV－1抗体结合。

洗涤去除未结合的酶联物，然后加入底物（p-NPP）。

如标本中含有HIV－1抗体，酶将使孔内液体由无色变为黄色，颜色的强度与标本中抗体含量成正比。

反应用EDTA终止，用酶标仪在405nm处测吸收峰而读取结果。

试剂盒中包括阳性及阴性对照，每板应做2个阳性对照及3个阴性对照，将阴性对照平均吸收值加0.18得到cutoff值，标本是通过与Cutoff值比较来判断是否为阳性或阴性。

第一次检测阳性标本应用同一标本再重复检测，如果重复检测仍为阳性，标本为重复阳性标本。

重复阳性标本用卡里普特公司的剑桥生物HIV－1Wester Blot试剂盒进一步确认。

    3．胶体金法检测HIV1/2抗体实验

胶体金法检测HIV抗体是一种不需要任何仪器设备的血清／血浆检测法，它利用免疫层析分析原理来快速检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，从而用于判断人体是否受到HIV1型／HIV2型病毒感染。

（1）方法和原理

    试剂盒采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清／血浆中是否含有HIV抗体，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的重组HIV抗原和质控区（C）的抗-protein A抗体。

测试时，血标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血标本中的HIV抗体与预包被在膜上的protein A胶体金结合物反应。

然后，混合物随之在毛细管向上层析，在测试区（T）与固定在膜上的重组HIV抗原反应。

如果血清中含有HIV－1抗体或HIV－2抗体，在测试区内（T）会出现一条红色条带，表明是阳性结果。

如果在测试区内（T）没有出现红色条带，则血清中不含有HIV抗体，表明是阴性结果。

无论HIV抗体是否存在于血清中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），质控区的抗Protein A与Protein A胶体金结合物反应出现一条红色条带。

质控区内（C）所显现的红色条带是判定是否有足够血标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

（2）结果判定

    阳性（＋）：

两条红色带出现。

一条位于测试区内（T），另一条位于质控区内（C）。

    阴性（－）：

仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区内（T）无红色条带出现。

无效：

质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

在任何情况下，应重新测试。

如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。

注意：

由于样本中HIV抗体滴度的不同，测试区（T）内的红色条带会显现出不同深浅的颜色。

但是，本试剂盒的测试结果不能做