人参皂苷对肝损伤的防治作用Word文档下载推荐.docx

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　　仪器

　　InfiniteM200pro酶标仪（瑞士帝肯）;

Lecia-DM2500微生物显微镜，德国Lecia公司。

　　药物与试剂

　　鲜人参，为5年生，产自吉林省抚松县，由长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科人参属人参PanaxginsengC.A.Meyer干燥根;

联苯双酯滴丸（浙江万邦药业有限公司，批号A02130407）;

56°

北京红星二锅头酒（北京红星二锅头酒厂，批号20140224）;

ALT试剂盒、AST试剂盒、MDA试剂盒、GSH试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20150112）;

TG试剂盒（浙江东瓯生物工程有限公司，批号2015040104）。

　　实验动物

　　清洁级ICR雄性小鼠，体质量20~22g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，动物合格证号：

SCXK-（吉）2014-005.

　　2实验方法

　　红参炮制

　　称取鲜人参约300g,用纱布包好，放入蒸参箱，在60min升温到100℃后蒸制6h,蒸制完毕后置于50℃烘干箱内烘干。

将烘干后的红参研碎成粉，过80目筛。

　　人参皂苷提取物（Ginsengsaponinextracts,GE）制备

　　称取红参粉末，加入8倍量80%乙醇，超声提取（500W,100Hz）30min,抽滤，滤渣加入6倍量乙醇超声30min,滤过，合并滤液，40℃水浴蒸干，加入适量水溶解，即得人参皂苷提取物（人参总皂苷含量为%），4℃下保存待用。

　　动物分组

　　取清洁级ICR雄性小鼠72只，正常喂养5d后，将其按体重平均分为6组，分别为对照组、阳性组（联苯双酯）、模型组及GE高、中、低剂量组，每组12只。

　　动物造模及给药

　　给药剂量按照成人日均用药量与小鼠给药量进行剂量换算，除对照组每天ig等体积的蒸馏水外，其余各组ig给予56°

白酒，给药剂量为mL/20g,1次/d,造模5d.给药组给予GE,低、中、高剂量组每日分别给予、、g/kg生药材浓度的GE,阳性对照组给予联苯双酯mg/kg,给药后1h给予56°

白酒，1次/d,连续30d.小鼠给药期间每周进行称质量并记录，并观察小鼠的毛色、饮食、行为及死亡情况。

　　样本采集

　　处理前禁食12h,给药及白酒1h后，小鼠摘眼球取血，常温静置后待其凝固，3000r/min离心15min,取血清，?

80℃保存待测。

采血后，迅速剖取肝脏，用冷生理盐水洗净，滤纸吸湿后，称取肝脏湿重，计算肝脏系数（肝脏系数=肝质量/体质量）。

取肝右叶做HE染色，肝左叶制备10%肝匀浆，匀浆制备方法：

用冷生理盐水冲洗肝脏至无血色，称质量，加入9倍量冷生理盐水机械匀浆，将匀浆液2500r/min离心20min,4℃，取上清。

　　生化指标检测

　　每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆，严格按照试剂盒操作方法进行小鼠血清ALT、AST、TG、肝匀浆MDA、GSH含量测定。

　　肝组织病理学检查

　　取小鼠肝脏右叶置于10%中性福尔马林中进行固定，经一定梯度浓度的乙醇脱水、石蜡包埋、切片进行HE染色，用显微镜观察肝组织病理变化。

　　数据处理

　　应用SPSS统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，组间比较采用最小显着差数法（LSD），数据均以x±

s表示。

　　3结果

　　小鼠状况观察

　　试验期间，GE中剂量组及阳性组死亡小鼠4只，其余各组死亡小鼠2只。

对照组小鼠精神状态正常，毛色正常，模型组小鼠毛色较差，造模期间，ig给予白酒后20min左右，出现醉酒状态，不自主行为增多，爬行不稳，有些小鼠呈现昏睡状态，给药组小鼠给予白酒20min后，醉酒状态较模型组稍好。

　　体质量及肝脏系数变化

　　各组小鼠体质量无统计学差异，与对照组相比，模型组小鼠肝质量增大（P<

），表明长期饮酒和乙醇的堆积造成小鼠肝脏受损肿大，质量增加可能与肝脏内脂肪堆积或其他物质生成有关。

给药组小鼠肝脏系数相较模型组有明显降低（P<

），GE高、中、低剂量组均有降低，但组间变化趋势不明显，GE对酒精引起的小鼠肝脏受损肿大有一定的缓解作用。

　　对小鼠血清ALT、AST、TG的影响

　　与对照组相比，模型组小鼠血清ALT（P<

）、AST（P<

）、TG（P<

）含量明显升高;

与模型组相比，GE高、中剂量组ALT含量降低（P<

），GE各剂量组均能降低AST和TG水平（P<

），联苯双酯组可明显降低ALT、AST水平。

但GE高、中、低剂量组组间呈现的量效关系不明显。

长期白酒灌胃会造成小鼠血清ALT、AST、TG含量增高，GE可明显降低血清TG的含量，对ALT、AST含量降低有一定作用，说明GE对小鼠酒精性肝损伤有一定保护作用。

　　对小鼠肝脏MDA、GSH的影响

　　小鼠肝匀浆MDA含量结果显示，模型组小鼠MDA含量高于对照组（P<

），GE各剂量组MDA含量低于模型组（P<

）。

模型组GSH含量低于对照组（P<

），GE各剂量组GSH含量高于模型组（P<

），GE可降低MDA含量，增加GSH含量，说明其可在一定程度上抵御肝脏内的氧化作用，从而保护肝脏进一步损伤。

　　病理观察结果

　　正常组肝细胞结构正常，肝细胞条索排列整齐;

模型组肝细胞变性坏死，有炎性细胞浸润，脂泡小而密集;

联苯双酯组炎性细胞浸润和坏死程度减轻

　　4讨论

　　本研究采用长期、固定剂量的酒精灌胃造模方法[4-5]来模拟长期饮酒的状态，形成慢性酒精性肝损伤模型。

通过实验观察，长期灌胃白酒的小鼠，不自主行为增多，会出现嗜睡、四肢无力、食欲减退、呼吸衰竭等状态，模型组小鼠的生化指标也表明长期白酒灌胃引起的肝功能的损伤，长期、固定剂量的酒精灌胃引起小鼠慢性酒精性肝损伤是可行的。

　　ALT、AST是检验肝脏损伤的一个重要指标，正常血清里ALT、AST含量极少，只有在肝细胞死亡破裂后肝细胞内的ALT、AST才会释放入血，血清中ALT、AST含量增加说明肝脏出现炎症。

乙醇经肝脏代谢过程中产生的活性氧会直接对肝细胞造成氧化损伤[6],形成过脂质氧化产物--MDA,其含量是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。

模型组小鼠肝组织MDA含量高于正常组，GSH含量低于正常组，肝脏长期的酒精代谢会造成肝脏内氧化物质的增多，还原物质减少，造成肝细胞氧化损伤。

　　同时肝脏脂质过氧化会产生脂肪酸的氧化，影响肝脏微管功能，致使肝脏内TG代谢障碍，长期的乙醇摄入，不仅增大了小鼠的肝质量、肝脏系数，也致使模型组小鼠较正常组小鼠TG的量明显增多。

　　红参醇提液中的成分主要是人参皂苷，红参中含有20多种人参皂苷，如人参皂苷Re、Rb1、Rh1、Rh2、Rd等，其人参皂苷Rg3、Rg2、Rh1的含量高于白参[7].研究发现人参皂苷20（S）-人参皂苷Rg3可明显抑制肝损伤小鼠ALT、AST的酶活性[8],人参皂苷Rb1可明显降低大鼠肝微粒体细胞色素P450酶与NADPH-P450的活性[9],人参皂苷Rh2可抑制肝纤维DNA的合成[10]等。

通过本研究发现，GE可明显降低长期白酒灌胃小鼠血清中TG的含量，对降低其ALT、AST作用不明显，对抑制肝脏内MDA的含量，增加GSH含量有一定作用，对长期饮酒所造成的肝损伤有一定的预防和保护作用，从而阻止肝脏向纤维化进一步恶化。

GE中、高剂量组与模型组的病理观察比较，GE可在一定程度上抑制肝细胞炎症发生，但抑制效果不明显，但可以显着减少小而密集的脂肪泡数量，GE中、高剂量组可明显抑制肝脏内的泡样损伤。

GE可能主要通过抑制体内活性氧对肝脏脂质过氧化、减少肝脏脂肪堆积这一途径来避免肝脏受损。

　　综合以上结果，人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作用，以中、高剂量效果最好，但红参保肝机制尚不明确，此研究为红参的保健开发和治疗酒精性肝损伤提供了一定的参考。