植物培养复习Word格式文档下载.docx
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打开放气阀，放出冷空气，再关闭放气阀。
压力表上升达0．1~0．15Mpa时，维持20~30min后，断电，待压力降至零时，打开入气阀，取出灭菌材料。
注意事项：
①对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。
而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；
②高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。
因此，调pH值时，可适当调高0.2－0.3个单位。
2.接种设备：
无菌超净工作台：
用于培养材料的消毒及接种。
使用前，用75％的酒精擦拭超净工作台面，将排风和杀菌按钮开启，灭菌20-30min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。
3.培养设备
①带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。
②恒温箱：
又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。
③摇床与转床：
在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。
如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。
但注意要设定适合的温度及转速。
4.驯化设备①温室②防虫网室
5、其它辅助设备①培养基灌装机及洗瓶机②空调机③除湿机④烘箱⑤冰箱⑥纯水机与蒸馏水发生器⑦天平和显微镜⑧酸度计
第二节培养基及其配制
4.有机附加物：
其对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。
其成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。
常用的有机附加物有:
⑴椰乳：
⑵香蕉：
⑶水解酪蛋白：
5.植物生长调节物
植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。
5.1生长素类（auxin）：
在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。
在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽。
天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。
在植物体内也易受到体内酶的分解。
一般生长素浓度的使用为0.05－5mg／L。
⑴IAA（吲哚乙酸）是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。
⑵NAA（萘乙酸）在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。
NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。
⑶IBA（吲哚丁酸）是促进发根能力较强的生长调节物质。
⑷2，4—D（2，4—二氯苯氧乙酸）强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。
适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。
5.2细胞分裂素类
细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。
这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6－BA（6－苄基氨基嘌呤）、KT（kinetin激动素）、ZT（zeatin玉米素）等，细胞分裂素0.05－10mg／L。
其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6—BA。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：
①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。
②促进细胞分裂与扩大。
③抑制根的分化。
5.3激素配比模式
生长素与细胞分裂素：
它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。
如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
高：
有利于根的形成和愈伤组织的形成；
适中：
有利于根芽的分化；
低：
有利于芽的形成
第三节植物组织培养灭菌及无菌操作技术
1．湿热灭菌（培养基）在制备后的24h内完成灭菌工序。
2.过滤灭菌（不耐热的物质）如一些抗生素类物
3.紫外线和熏蒸灭菌（空间）
（1）紫外线灭菌
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。
紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强
（2）熏蒸灭菌
用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。
这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
4.喷雾灭菌（物体表面）
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。
5.植物材料表面用消毒剂灭菌（外植体）
植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。
无菌操作技术
接种前，先用紫外灭菌30min。
进入接种室，先将超净工作台用70%酒精棉擦干净，将所用的器械用酒精消毒，等器械冷却后进行接种。
接种过程中要注意防止染菌，手臂不能在外植体上面来回移动，而且接种速度要快。
1.比较固体培养基和液体培养基的优缺点
2.配制MS培养基时，琼脂和蔗糖的加入量一般为多少？
30g、8g
3.培养基的成分包括哪几类？
各有何作用？
主要成分包括：
无机盐类（大量和微量元素）、维生素类、氨基酸类、有机附加物、植物生长调节物质、糖类，水和琼脂等。
4.在培养基成分中什么组分决定着外植体发育方向？
植物生长调节物
5.抗生素的作用是什么？
对微生物有抑制和杀灭用。
可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。
第三章第二节愈伤组织培养P34
愈伤组织培养是将母体植株上的各个部分切下作为外值体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。
（一）诱导期：
离体培养的细胞在分裂前发生的变化：
①
在切离和培养后较短时间内，细胞的气体交换迅速增加，特别是在加有生长素的培养基中培养时，比无生长素的培养基中气体交换增加一倍。
②多聚核糖体不断增加。
截止M期前，每个细胞中的RNA含量增加到300％；
③蛋白质发生周期性的积累。
每个分裂细胞的总增加量约为200％；
④
酶活力也发生一定的变化。
DNA复制前，DNA聚合酶活力增加；
分裂前，与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加。
（二）分裂期
①
细胞的数目迅速增加。
胡萝卜组织培养7d后，细胞数可增加10倍。
②
每个细胞平均鲜重下降。
这是由于鲜重的增加赶不上细胞数目的增加之故。
③
正在分裂的细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞一样。
④细胞的核和核仁增大到最大。
⑤细胞中的RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
⑥随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。
（三）形成期
（1）细胞分裂部位和方向发生改变
（2）分生组织瘤状结构和维管组织形成（3）细胞的体积不再减小（4）出现各种类型的细胞如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞以及细胞丝状体等。
（5）出现一定的形态特征
不同外植体来源的愈伤组织有一定的均一性。
如叶栅栏组织细胞和根细胞在大小和形态上有一定的差异，但是两者诱导形成的愈伤组织就失去了原有的差异，变得比较均一。
若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化，有的紧密坚实，有的疏松脆弱。
质地不同的两种愈伤组织有时是可互变的，有时是不可逆的。
愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：
（1）愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，即无芽的根或无根的芽；
（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，大多植物为这种情况
（3）先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株，
（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接，但这种情况少见
细胞经分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚和子叶期，进而成为成熟的有机体。
由胚状体形成完整植株，与不定芽和根发生相比，有以下三个特征：
第一、具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化芽端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性;
第二、胚状体的维管组织与外植体的维管织组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系；
第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y’形，而不定芽的维管组织无此现象。
（1）加快了园艺植物新品种和良种繁育速度，特别是对于无性繁殖的果树、观赏树木等植物；
（2）培养无病毒苗木，这在香蕉、马铃薯、柑橘、草莓等植物上均得到了成功应用；
（3）获得倍性不同的植株，这对于无性繁殖园艺植物的育种，具有较大的利用价值因为愈伤组织形成过程中易发生染色体的核内加倍；
（4）克服远缘杂交困难；
（5）利于种质资源长期保存和远距离运输，应用组织培养保存种质资源具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，易于长远距离运输，而且不致受病虫害的侵袭，并便于交流的优点；
（6）提供育种中间材料，通过组织培养可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质分离、融合或遗传转化提供优质材料；
（7）诱发和离体筛选突变体；
（8）制造人工种子，为某些濒危和珍贵物种的繁殖，提供一种高效的手段等。
第五六七章
P48
（2）、分批发酵中细胞生长特点在一个间歇培养的周期中，细胞的数量增加主要是在对数生长期实现的。
分批培养细胞生长特点：
在分批培养过程中，随着细胞和底物、代谢物的浓度等的不断变化，细胞生长可分为停滞（延迟）期、对数生长期、直线期、减慢期和停止期等四个阶段，
污染来源
１、真菌：
种类丰富，分布广泛，繁殖快速，无处没有，无处不在。
2、细菌
细菌是无孔不入的微生物，为避免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果不十分理想，因为这些材料虽然能杀死细菌，却充满了化学物质。
3、组织培养过程中的污染源
（1）户外风大菌类进屋机会多
（2）屋内太潮菌类繁衍多
（3）培养基及器皿灭菌不彻底
（4）外植体带菌
（5）接种不正确
（二）预防措施：
通风去湿光照防霉改进外植体消毒方法或使用抗生素
3.2褐变问题
•外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。
•分为酶促褐变和非酶促褐变。
酶促褐变的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。
在褐变过程中，酚类物质氧化形成醌类物质，它们经过非酶促聚合，形成黑褐色物质（羟醌与黑色素等），引起褐变的发生。
※褐变的主要原因
1）品种：
由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有些品种的外植体在接种后不易褐变。
2）生理状态：
一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
3）培养基成分：
浓度过高的无机盐会使褐化程度增加，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。
4）培养条件不当：
例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
※防治措施1）选择合适的外植体：
一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。
2）合适的培养条件：
无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
（3）使用抗氧化剂：
在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。
（4）使用吸附剂：
使用聚乙烯基吡咯烷酮、活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
3.3玻璃化问题p64
1、玻璃化定义：
也称超水化作用，是离体培养过程中试管苗发生形态、生理和代谢异常的现象。
这类植物体被称为“玻璃苗”,这种现象称为玻璃化现象,细胞过度吸水，叶片肿胀、扭曲，枝条和叶呈水浸状，半透明状，脆弱易碎。
组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题，是不能很好适应培养基和培养环境的结果。
四、光自养微繁殖技术——无糖组培技术p64
1、概念：
指通过改善CO2的供应量，适当提高光照，就可以促进培养物自身的光合作用能力，使其能够在无糖培养基上通过光合作用进行自养生长，这种培养方式称为自养培养或无糖培养。
2、意义：
①降低了培养基制作成本；
②简休了生根和移栽程序降低了生产成本。
二脱毒方法及原理
（一）物理方法
1、高温处理又称热疗法原理:
一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下（35-40℃）即钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害.
（1）温汤处理将材料放置50℃左右热水中浸数分钟至几小时，可使病毒失活。
此法简便易行，适于离体材料和休眠器官的处理，缺点是易伤害材料。
（2）热风（空气）处理将盆栽植物移入室内或生长箱中，以35℃～40℃温度处理几十分钟至数月。
按植物种类、器官类别和生理状况及待脱除病毒的种类等，确定处理温度与处理时间。
2、低温处理又称冷冻疗法原理：
降低温度能使病毒活力下降。
（二）化学处理
1.病毒抗血清预处理：
用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。
2.RNA抑制剂处理：
烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。
放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。
3.三氯唑核苷：
病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。
（三）生物脱毒方法
1、茎尖分生组织培养2、微体嫁接脱毒3、愈伤组织培养脱毒4、珠心胚培养脱毒5、花药培养脱毒
三、脱毒苗鉴定、保存和繁殖
“脱毒苗”——无病毒苗是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。
要脱除植株体内所有病毒包括未知病毒是不可能的。
（一）植物病毒的检测方法1、直接检测法:
直接观察2、电镜检测法3、指示植物法4、血清学检测法5、分子检测技术：
PCR技术、探针杂交技术
第八章第一节植物胚胎培养
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房,胚珠）进行人工离体无菌培养,使其发育成幼苗的技术。
包括胚培养、胚珠培养和子房培养。
广义的胚胎培养还包括胚乳培养和离体授粉等内容。
胚培养是指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行培养的技术。
植物胚胎培养的意义
1、克服杂种胚的败育,获得稀有杂种
2、获得单倍体和多倍体植株
3、打破种子休眠，促进胚萌发
4、快速繁殖良种，缩短育种周期
5、克服种子生活力低下和自然不育性,提高种子发芽率
6、胚培养材料可作为转基因受体材料
◎植物胚胎发生过程：
原胚－球形胚－心型胚－鱼雷胚－子叶胚
影响幼胚培养成功的因素
（1）培养基的渗透压、生长调节剂及其它附加物的影响
（2）环境条件
◎光照条件：
●弱光和黑暗更有利于幼胚培养。
●大多数处于球形期至心形期的幼胚，需要在黑暗条件下培养2周后再给予一定时间的光照。
●在胚培养的形态分化期，光照对胚芽生长有利，而黑暗则对胚根生长有利，因此以光暗交替培养为好。
对多数植物来说，每天保持16h光照、8h黑暗较为合适。
另外，光能抑制幼胚的早熟萌发。
◎温度幼胚培养的温度以该植物种子萌发的适宜温度为好。
一般以25~30℃为宜。
有些植物的幼胚培养需要在给予适宜温度之前要求一定的低温条件。
（3）胚乳看护培养
胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。
胚乳是独特的组织，它的功能是为胚发育和种子萌发提供营养。
花药培养指用植物组织培养技术将发育到一定阶段的花药剥离下来（切去花丝部分），接种在培养基上进行培养，最终形成完整植株的技术。
植物花药培养与花粉培养的意义
1、获得纯系材料进行单倍体育种，提高育种效率。
2、利用获得的纯合二倍体材料进行植物遗传规律研究，为遗传育种提供依据、减少育种的盲目性。
3、克服远缘杂种不亲合性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种。
4、利用在远缘杂交F1代花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行植物细胞
花药培养过程包括：
（一）培养材料的选择
（二）材料的预处理（三）外植体消毒与接种（四）培养（五）植株再生（六）生根（七）驯化与移栽（八）单倍体植株的染色体加倍。
花药培养的材料选择要注意以下几个问题：
1、选择适宜培养的植物材料
2、将适宜的母株置于一定的温度、光照和湿度条件下培育一定时间以获得健康母株，并使其向生殖阶段转变。
3、选择适龄的供体植株进行培养。
一般来说，幼年植株的花药培养力较强。
4、确定花粉细胞所处的发育阶段。
处于单核小孢子阶段的花粉最具活力。
预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理目的：
是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。
适当的预处理能使绿苗产量大量增加。
（二）预处理方法：
主要是对花药进行适度的逆境处理，包括：
1、温度预处理
（1）低温预处理：
是指在接种之前将培养材料用0℃以上的低温处理一段时间后，再接种到适宜的培养基上进行培养。
耐寒植物比喜温植物处理的温度可低些◆较低温度处理时间要短，较高温度处理时间宜长
低温处理的作用机理：
A、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育；
B、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。
（2）低温后处理：
低温后处理与低温处理的区别在于：
完成接种操作后，再将整瓶材料置于适宜的低温条件下处理一段时间，再转移到正常的组织培养条件下进行培养，从而提高花粉诱导率。
（3）热击处理：
是指接种花药后，先在较高温度下（一般为30~35℃）培养一段时间，然后再转移至正常温度下继续培养的方法。
一般热击温度越高，处理时间越短。
2、化学预处理◎指花药在接种前，先用不同的化学物质处理一段时间，然后再移至正常条件下继续培养的方法。
◎包括糖类、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。
◎甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。
◎秋水仙素作用机理是通过改变小孢子的有丝分裂途径，从而诱导其向体细胞生长的途径分裂，主要扰乱了微管细胞骨架的活动，促使单核花粉的细胞核移向中央，而导致均等分裂。
3、物理预处理◎适宜的高压电场处理可以有效提高番茄花药培养的效率。
◎不同剂量的γ射线处理可在一定程度上诱导番茄花药愈伤组织的发生。
◎离心重力作用能够破坏微管并影响小孢子发育。
◎不同强度的磁场处理花椰菜花药，可以明显提高愈伤组织诱导率，且花药对培养基的选择性也降低。
单倍体植株的染色体加倍常用的化学诱变剂：
秋水仙素、8-羟基喹啉、对二氯苯、富民农等。
第四节种质:
指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质
种质保存:
利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下去
离体保存的意义:
1.可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资源的丢失。
2.节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。
3.一旦利用可快速繁殖；
也利于种质交换。
P85
（一）常温保存温度:
20~25℃
改变培养基中营养物质的浓度：
降低无机盐浓度；
提高渗透压：
甘露醇、蔗糖；
增加生长调节物质
改变培养的环境条件：
降低氧的含量
●特点:
保存时间短,1年转3~5次
（三）超低温保存也叫冷冻保存，指在-196℃的液氮超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜条件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。
植物试管受精
离体授粉是指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠完成受精而结实的过程。
由于从花粉萌发、到精卵细胞融合形成种子，直至种子萌发产生幼苗都是在试管内完成的，所以也称其为试管受精。
离体受精是指离体及人工控制的环境下，精卵细胞融合形成合子的过程。
它包括配子的分离、雌雄配子融合和合子培养三个阶段。
（一）离体授粉与离体受精的意义
1、克服远缘杂交不亲合性2、克服自交不亲和性3、诱导孤雌生殖4、双受精及胚胎早期发育机理的研究
（二）离体授粉和离体受精技术
1、离体传粉技术首先进行了离体授粉实验，对罂粟的带胚座组织的离体胚珠进行人工授粉，获得了能正常萌发的种子。
离体授粉根据授粉的部位可分为：
离体胚珠授粉离体胎座授粉离体柱头授粉
子房试管授粉
直接引入法：
在无菌条件下，用锋利刀片将子房壁或顶端切开一个小口，把花粉悬浮液直接滴入切口后进行培养。
注射法：
用无菌注射器吸取花粉悬浮液，从子房基部或上端切口注入子房，基部切口可用凡士林封口然后接种于培养基上。
胚珠试管受精胚珠剥离后可从胎座上切下单个胚珠授粉，也可将带着完整胎座或部分胎座的胚珠接种到培养基上，并撒播花粉。
¡
1、直接在胚珠表面（蘸满有助花粉萌发的培养基）授予无菌的花粉；
2、预先培养花粉，将花粉撒在培养基表面，再接种带有胚座的裸露的胚珠于花粉培养基上。
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