DNARNA合成常见问题解答文档格式.docx
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26.作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸
实验
27.怎样制备双链DNA?
Q1.如何保存寡核苷酸？
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通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。
寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。
若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。
另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；
碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。
Q2.如何重悬寡核苷酸？
为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液（10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0），而不用无菌水来溶解寡核苷酸。
重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。
寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。
Q3.如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？
脱水的寡核苷酸是长期稳定的。
即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况（没有引入使寡核苷酸降解的污染物）即使在室温中放置超过一星期也能使用。
Q4.荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？
如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。
为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。
由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰
Q5.如何定量合成的寡核苷酸?
合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。
通常通过测量紫外吸光度值（OD值）来定量。
Q6.如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？
寡核苷酸的量经常用OD值来描述。
1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。
因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。
dT:
8.8ml/µ
mol
dG:
11.7ml/µ
mol
dC:
7.3ml/µ
dA:
15.4ml/µ
对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。
它的浓度可通过下式来计算：
O.D.=εC（内径1cm的比色杯）
Q7.如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT,OD值是0.7，那么它的量是多少？
首先，用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少：
ε=11.7×
3+7.3×
4+15.4×
5+8.8×
6=194.1（ml/mmole）
然后，通过下式来计算寡核苷酸的浓度：
O.D.=εC，C=O.D./εC
C=0.7/194.1=0.0036（µ
mol/ml）=3.6（nmol/ml）
最后，OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。
Q8.如何计算寡核苷酸的分子量?
寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算：
M.W.=（NA×
249.2）+（NC×
225.2）+（NG×
265.2）+（NT×
240.2）+（寡核苷酸长度-1）×
63.98+2.02
NA=总A数
NC=总C数
NG=总G数
NT=总T数
Q9.如何测定寡核苷酸的质量?
通常，合成的寡核苷酸的质量用摩尔数来描述，常用nmol。
用寡核苷酸的摩尔数或寡核苷酸的分子量可以计算寡核苷酸的量：
寡核苷酸质量（ng）=分子量（M.W.）×
摩尔数（nmol）
Q10.如果不知道寡核苷酸的碱基组成，有什么办法来定量合成的寡核苷酸？
1OD值的单链寡核苷酸大约33mg，双链寡核苷酸约为50.mg。
然而对于较短的寡核苷酸，上述值偏差较大。
因此，最好用Q6中提到的适合于短寡核苷酸质量的计算方法，可以得到更精确的结果。
Q11.如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?
Tm（解链温度）是指50%双链被解开成单链时的温度。
寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。
Tm
值
有多
种计算方法。
我们使
用近
邻
法（PNAS
83,3746-50）来计算。
用这种方法计算前，也有多种方法来估测。
如果是15个碱基以下，那么有一种好的方法来估算，对于A和T，可以乘以2癈，对于C和G，可以乘以4癈然后相加，这叫做Wallace法则。
Tm=2℃（A+T）+4℃（G+C）
另一种方法来估计长链中GC含量
Tm=81.5+0.41（%GC）-500/L+16.6log[M]
（L:
寡核苷酸的长度；
M:
1价阳离子的浓度）
但这些方法不能消除碱基堆积的影响，结果并不准确，所以近邻法被广泛的应用。
但是，对于在60-70bp或15bp以下的寡核苷酸的测定，近邻法还是有缺点。
Bioneer使用的近邻法具有新的特点。
它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响，并且通过热力学来测定，可以更有效的测定Tm值。
比如5'
-GC-3'
和5'
-CG-3'
的序列用热力学方法测定结果是不同的。
计算方法如下：
依靠热力学方法，焓和熵通过两个碱基来确定。
[salt]是指一价阳离子的浓度，[Oligo]是指反应过程中的寡核苷酸浓度。
R是指气体常数（1.987cal·
K-1mol-1）。
Bioneer用近邻法计算Tm值时，使用的是50mM的盐浓度和1nM的寡核苷酸的浓度。
Bioneer会给每一个用户提供Tm值，但这只是估计值，我们不能保证精确性，因此这个值仅供用户参考。
如果没有扩增出产物，你可以把退火温度降到Tm值以下4～5癈。
如果有许多非特异性的产物，你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。
Q12.为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?
Bioneer使用的Tm值的计算方法和我们通常的计算方法是不同的。
我们通常只是简单的乘以A、G、C、T的数目，但序列不同碱基的Tm值亦会不同。
如Tm值取决于序列中的每一个碱基，即使碱基数相同但序列不同时，Tm值也将不同。
Q13.用什么方法调整寡核苷酸的浓度？
首先，在Bioneer提供的数据表或报告单中的100pmol/靗，是用来加入TE缓冲液或无菌水，以使管中寡核苷酸的终浓度达到100pmol/靗。
例如,数据表或报告单中是189.0和209.2时，则应向两个管中分别加入相应量的无菌水,即可使每个管中的寡核苷酸浓度达到100pmol/µ
l。
每一个管中寡核苷酸含量通过下式可以计算如下：
189.0µ
l×
100pmol/µ
l=18,900pmol=18.9nmol,
209.2µ
l=20,920pmol=20.92nmol
如果所要的终浓度是0.5µ
M，pmol/µ
l需要换µ
M。
l=100×
106
pmol/106µ
106×
10-12
mol/L=10-4
mol/L
=10-4
×
106µ
=102µ
mol/L
=100µ
M
终浓度换算为100µ
M，如果需要的浓度是0.5µ
M的，加入终体积的1/200的引物量，以使引物终浓度为0.5µ
PCR反应的终体积是50µ
l，所以需要加50/200=0.25µ
l的引物，以使终浓度达到0.5µ
Q14.单位换算表
科学系统单位:
10-1=deci[d]
101=deca[da]
10-2=centi[c]
102=hecto[h]
10-3=milli[m]
103=kilo[k]
10-6=micro[m]
106=mega[M]
10-9=nano[n]
109=giga[G]
10-12=pico[p]
1012=tera[T]
10-15=femto[f]
1015=peta[P]
10-18=atto[a]
1018=exa[E]
10-21=zepto[z]
1021=zetta[Z]
10-24=yocto[y]
1024=yotta[Y]
----------------------------
寡核苷酸单位换算的例子:
1pmol/µ
l
=1×
10-12mol/1×
10-6L
10-6mol/L
=1µ
Q15.如何合成寡核苷酸?
目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通过使用“亚磷酸三脂”方法
将单体连接，形成天然
的3'
-5'
磷
酸
二
脂
键
。
Koster发现了β-氰乙基亚磷酰胺并作为构建单体，现在普遍的用于寡核苷酸的合成（Nucl.AcidsRes.1984,12,4539;
TetrahedronLett.1983,24,5843）。
通过“亚磷酸三脂”的方法使用β-氰乙基亚磷酰胺，合成效率能够达到（98%）而合成时间比其它寡核苷酸的合成方法更短。
而且，由于单体β-氰乙基亚磷酰胺在激活以前很稳定，这是对合成寡核苷酸来说所必需的，他们能储存更长的时间。
当寡核苷酸共价的连接在固相载体上就可以使其不被过量溶解β-氰乙基亚磷酰胺和结合试剂的作用下，寡核苷酸被合成。
在各种各样的固相载体中，可控孔度玻片已经在近年广泛使用了，这种玻片是由均匀的玻璃基质组成，上面有固定尺寸的孔。
整个寡核苷酸的合成通过一系列的反应完成，其中包括四个循环反应：
脱保护，连接，氧化，加帽。
脱保护
通过第一个循环—脱保护，CPG裂解出5'
保护基团DMT。
酸性条件对于脱保护是必需的，通常使用3％三氯乙酸。
据报道，寡核苷酸在酸性环境中易脱嘌呤，尤其是对于腺苷。
因为三氯乙酸有很强的酸性，所以用三氯乙酸脱保护时，反应时间不应该太长。
比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性较弱，能够在一些情况下避免脱嘌呤问题。
脱保护后产生的DMT阳离子呈现出一种深橘色。
通过测定吸光度，来监测反应效率。
连接
脱保护后，CPG上的5'
-羟基暴露，结合核苷β-氰乙基亚磷酰胺，三亚磷酸酯氧化变成磷酸三脂，然后按顺序连接。
对于核苷β-氰乙基亚磷酰胺，为了避免合成寡核苷酸过程中负反应的发生，碱基的环外氨基被保护以免形成酰胺结构。
苯甲酰基用于保护酰苷和胞苷。
另一方面，异丁酰基用于鸟苷碱基保护。
胸苷碱基中没有环外的胺基，所以不需要保护。
β-氰乙基亚磷酰胺用于保护所有核苷的5'
-羟基。
因为核苷2-氰乙基亚磷酰胺在正常条件下非常稳定，不能直接和正在合成链上游离的5'
-羟基功能基团发生反应。
所以，它们必须首先通过一种弱酸性激活剂激活。
在各种激活剂中，四唑作为标准激活剂具有很强的激活作用。
四唑已经被认为具有双重作用：
它质子化2-氰乙基亚磷酰胺的二异丙氨基，产生亲核基团，形成具有活性的四唑膦中间产物。
用这种被激活的核苷亚磷酰胺试剂耦联反应快（不到2分钟），产量高。
氧化
新合成的亚磷酸盐和核苷酸之间的键合不稳定，对酸和碱均很敏感。
因此，三价的亚磷酸三脂被氧化成五价的磷酸三脂。
碘是温和的氧化剂，在碱性的四氢呋喃溶液中作为氧的供体。
此步反应非常快，在三十秒内就可以完成。
加帽
因为结合反应在特定的时间内不能够定量，在每一步结合反应中都有一小段提前终止的序列产生。
如果这些序列进一步参与反应，产物将很难从混合序列中分离出来。
通过加帽，即将自由羟基乙酰化，解决了这个问题。
乙酰化可由强的乙酰化试剂完成，该试剂是由等摩尔的醋酸酐和N-甲基咪唑组成，反应可在30秒内完成。
氧化后，核苷酸加入，循环完成。
寡核苷酸合成后，移去增长链5'
-末端的DMT基团，下一个核苷酸的聚合循环开始。
整个寡核苷酸合成后，借助浓氨水的处理，寡核苷酸从固相载体上分离，同时碱基和磷酸基去保护。
Q16.标准寡核苷酸结构
Q17.Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?
合成量0.025µ
mol:
50mer
合成量0.05µ
合成量0.1µ
100mer
合成量0.2µ
合成量1.0µ
130mer
Q18.当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50nmol，为什么?
50nmol的寡核苷酸合成不意味着能得到50nmol的最终产品。
50nmol是指在寡核苷酸合成开始时固相载体负荷的数量。
寡核苷酸通常是反应所要求的量而不是最终产率，用户得到的核苷酸的数量自然要比要求的少。
终产率受寡核苷酸长度、碱基组成和连接效率的影响。
Q19.能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?
众所周知，含高百分比的“G”寡核苷酸不容易被合成，特别是序列中包含一行“G”。
有报道，如果有四个或更多的“G”排成一行，寡核苷酸将趋向形成鸟嘌呤四聚体（PoonandMacGregor,Biopolymers,
1998,45,427-434）。
通过次黄嘌呤核苷置换部分G，就能避免四聚体鸟苷的形成。
Q20.能提供寡核糖核酸（RNA）合成吗？
是的，我们能合成。
我们能提供2'
-OH或/和2-O-甲基结构的寡核糖核苷酸，也能合成由DNA和RNA组成的寡核苷酸。
Q21.合成的寡核苷酸在3'
位有磷酸基吗？
如果没有殊要求,合成的寡核苷酸在3'
或5'
端均无磷酸基。
如果你想要3'
有磷酸基的寡核苷酸，你应该在订单上标注清楚在3'
端进行磷酸化修饰。
Q22.简并引物及通用引物是什么？
R<
-a或g
Y<
-c或t
M<
-a或c
K<
-g或t
S<
-g或c
W<
-a或t
V<
-a,c或g
H<
-a,t或c
B<
-g,t或c
D<
-g,a或t
N<
-a,c,g或t
Q23.怎样纯化合成的寡核苷酸？
为了纯化合成的寡核苷酸，Bioneer采取了几种不同的方法如，脱盐，BioRP,HPLC及PAGE。
脱盐
寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。
通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-氰乙氧基--酸二脂键的保护基团以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。
然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。
所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。
脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。
尽管脱盐纯化可以移除所有的非必需有机杂质，但它不能有效移除合成中产生的微量的（每个联结步骤中不超过2%）提前终止的寡核苷酸杂链。
不过，脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究的。
BioRP
如果寡核苷酸合成以“三苯甲基”的形式完成，则N末端包含5'
-DMT基团，而提前终止的寡核苷酸不包含该基团。
因为DMT基有强亲脂性，有5'
-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂具有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用来进行寡核苷酸的纯化。
利用反向树脂和5'
-DMT寡核苷酸间存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团这一原理，我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
HPLC
如果合成的寡核苷酸应用于克隆，定向突变或定量的基因检测，那么对其纯度要求较高。
脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，而HPLC纯化法被广泛地用于这个目的。
作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸的纯化。
阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。
反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。
因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35mer）。
PAGE
对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶作为纯化基质。
尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。
Q24.用于芯片分析的60mer寡核苷酸如何被纯化呢?
我们推荐PAGE纯化法用于60mer寡核苷酸的纯化。
通常，长核苷酸（大于50mer）被推荐使用PAGE纯化法。
Q25.修饰寡核苷酸
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