DNARNA合成常见问题解答文档格式.docx

1、26. 作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸实验27. 怎样制备双链DNA?Q1. 如何保存寡核苷酸？ TOP 通常，寡核苷酸应该-20保存，该温度下能稳定保存一年以上。寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。Q2. 如何重悬寡核苷酸？ 为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH8.0），而不用无菌水来溶解寡核苷酸。重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以

2、长期使用。寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？ 脱水的寡核苷酸是长期稳定的。即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况（没有引入使寡核苷酸降解的污染物）即使在室温中放置超过一星期也能使用。Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？ 如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20保存。由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸? 合成的

3、寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。通常通过测量紫外吸光度值（OD值）来定量。Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？ 寡核苷酸的量经常用OD值来描述。1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。dT: 8.8 ml/moldG: 11.7 ml/mol dC: 7.3 ml/dA: 15.4 ml/ 对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。它

4、的浓度可通过下式来计算 ：O.D. =C （内径1 cm的比色杯）Q7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD值是0.7，那么它的量是多少？ 首先，用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少 ： = 11.7 3 + 7.3 4 + 15.4 5 + 8.8 6 = 194.1 （ml/ mmole）然后，通过下式来计算寡核苷酸的浓度：O.D. =C，C = O.D./CC = 0.7 /194.1 = 0.0036 （mol/ml） = 3.6 （nmol/ml）最后，OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。Q8. 如何计算寡核

5、苷酸的分子量?寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算：M.W. =（NA 249.2） + （NC 225.2） + （NG 265.2） + （NT 240.2） + （寡核苷酸长度-1） 63.98 + 2.02NA =总 A数NC = 总C数NG = 总G数NT = 总T数Q9. 如何测定寡核苷酸的质量? 通常，合成的寡核苷酸的质量用摩尔数来描述，常用nmol。用寡核苷酸的摩尔数或寡核苷酸的分子量可以计算寡核苷酸的量： 寡核苷酸质量（ng） =分子量（M.W.）摩尔数（nmol）Q10. 如果不知道寡核苷酸的碱基组成，有什么办法来定量合成的寡核苷酸？ 1 OD值 的单 链寡 核苷酸大约33

6、 mg，双链 寡 核 苷 酸 约为 50.mg。然而对于较短的寡核苷酸，上述值偏差较大。因此，最 好 用 Q6 中 提 到 的 适合于短 寡 核 苷 酸 质 量的计算方法，可以 得 到 更 精 确的 结 果。Q11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值? Tm（解链温度）是指50%双链被解开成单链时的温度。寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。Tm 值 有 多 种 计 算 方 法 。我 们 使 用 近 邻 法 （ P N A S 8 3 ,3 7 4 6- 5 0 ）来计算。用这种方法计算前，也有多种方法来估测。如果是15个碱基以下，那么有一种好的方法来估算，对于A和T，可以乘以2癈，对于C和G

7、，可以乘以4癈然后相加，这叫做Wallace法则。 Tm= 2 （A + T） + 4 （G + C）另一种方法来估计长链中GC含量Tm = 81.5 + 0.41（%GC） - 500/L + 16.6 logM（L:寡核苷酸的长度；M:1价阳离子的浓度） 但这些方法不能消除碱基堆积的影响，结果并不准确，所以近邻法被广泛的应用。但是，对于在60-70 bp或15bp以下的寡核苷酸的测定，近邻法还是有缺点。 Bioneer使用的近邻法具有新的特点。它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响，并且通过热力学来测定，可以更有效的测定Tm值。比如5 -GC-3 和5 -CG-3的序列用热力学方法测定结

8、果是不同的。计算方法如下： 依靠热力学方法，焓和熵通过两个碱基来确定。salt是指一价阳离子的浓度，Oligo是指反应过程中的寡核苷酸浓度。R是指气体常数（1.987 calK-1mol-1）。Bioneer用近邻法计算Tm值时，使用的是50 mM的盐浓度和1 nM的寡核苷酸的浓度。 Bioneer会给每一个用户提供Tm值，但这只是估计值，我们不能保证精确性，因此这个值仅供用户参考。如果没有扩增出产物，你可以把退火温度降到Tm值以下45癈。如果有许多非特异性的产物，你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。Q12. 为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同? Bioneer使

9、用的Tm值的计算方法和我们通常的计算方法是不同的。我们通常只是简单的乘以A、G、C、T的数目，但序列不同碱基的Tm值亦会不同。如Tm值取决于序列中的每一个碱基，即使碱基数相同但序列不同时，Tm值也将不同。Q13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度？ 首先，在Bioneer提供的数据表或报告单中的100 pmol/靗，是用来加入TE缓冲液或无菌水，以使管中寡核苷酸的终浓度达到100 pmol/靗。例如,数据表或报告单中是189.0和209.2时，则应向两个管中分别加入相应量的无菌水,即可使每个管中的寡核苷酸浓度达到100 pmol/l。每一个管中寡核苷酸含量通过下式可以计算如下：189.0l100

10、pmol/l = 18,900 pmol = 18.9 nmol,209.2l = 20,920 pmol = 20.92 nmol如果所要的终浓度是0.5M，pmol/l需要换M。l = 100 106pmol/106106 10-12mol/L = 10-4mol/L= 10-4106 = 102mol /L= 100 M终浓度换算为100M，如果需要的浓度是0.5M的，加入终体积的1/200的引物量，以使引物终浓度为0.5PCR反应的终体积是50l，所以需要加50/200 = 0.25l的引物，以使终浓度达到0.5Q14. 单位换算表科学系统单位: 10-1 = deci d 101 =

11、 deca da 10-2 = centi c 102 = hecto h 10-3 = milli m 103 = kilo k 10-6 = micro m 106 = mega M 10-9 = nano n 109 = giga G 10-12 = pico p 1012 = tera T 10-15 = femto f 1015 = peta P 10-18 = atto a 1018 = exa E 10-21 = zepto z 1021 = zetta Z 10-24 = yocto y 1024 = yotta Y-寡核苷酸单位换算的例子:1 pmol/l= 110-12 m

12、ol/110-6L10-6 mol/L= 1Q15. 如何合成寡核苷酸? 目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通过使用“亚磷酸三脂”方 法 将 单 体 连 接 ，形 成 天 然的 3-5磷 酸 二 脂 键 。Koster发现了-氰乙基亚磷酰胺并作为构建单体，现在普遍的用于寡核苷酸的合成（Nucl. Acids Res. 1984, 12,4539; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843）。通过“亚磷酸三脂”的方法使用-氰乙基亚磷酰胺，合成效率能够达到（98%）而合成时间比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且，由于单体-氰乙基亚磷酰胺在激活以前很稳定，这是对合成寡核苷酸来说

13、所必需的，他们能储存更长的时间。当寡核苷酸共价的连接在固相载体上就可以使其不被过量溶解-氰乙基亚磷酰胺和结合试剂的作用下，寡核苷酸被合成。在各种各样的固相载体中，可控孔度玻片已经在近年广泛使用了，这种玻片是由均匀的玻璃基质组成，上面有固定尺寸的孔。 整个寡核苷酸的合成通过一系列的反应完成，其中包括四个循环反应：脱保护，连接，氧化，加帽。脱保护 通过第一个循环脱保护，CPG裂解出5保护基团DMT。酸性条件对于脱保护是必需的，通常使用3三氯乙酸。据报道，寡核苷酸在酸性环境中易脱嘌呤，尤其是对于腺苷。因为三氯乙酸有很强的酸性，所以用三氯乙酸脱保护时，反应时间不应该太长。比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性较弱

14、，能够在一些情况下避免脱嘌呤问题。脱保护后产生的DMT阳离子呈现出一种深橘色。通过测定吸光度，来监测反应效率。连接 脱保护后，CPG上的5-羟基暴露，结合核苷-氰乙基亚磷酰胺，三亚磷酸酯氧化变成磷酸三脂，然后按顺序连接。对于核苷-氰乙基亚磷酰胺，为了避免合成寡核苷酸过程中负反应的发生，碱基的环外氨基被保护以免形成酰胺结构。苯甲酰基用于保护酰苷和胞苷。另一方面，异丁酰基用于鸟苷碱基保护。胸苷碱基中没有环外的胺基，所以不需要保护。-氰乙基亚磷酰胺用于保护所有核苷的5-羟基。 因为核苷2-氰乙基亚磷酰胺在正常条件下非常稳定，不能直接和正在合成链上游离的5-羟基功能基团发生反应。所以，它们必须首先通过

15、一种弱酸性激活剂激活。在各种激活剂中，四唑作为标准激活剂具有很强的激活作用。四唑已经被认为具有双重作用：它质子化2-氰乙基亚磷酰胺的二异丙氨基，产生亲核基团，形成具有活性的四唑膦中间产物。用这种被激活的核苷亚磷酰胺试剂耦联反应快（不到2分钟），产量高。氧化 新合成的亚磷酸盐和核苷酸之间的键合不稳定，对酸和碱均很敏感。因此，三价的亚磷酸三脂被氧化成五价的磷酸三脂。碘是温和的氧化剂，在碱性的四氢呋喃溶液中作为氧的供体。此步反应非常快，在三十秒内就可以完成。加帽 因为结合反应在特定的时间内不能够定量，在每一步结合反应中都有一小段提前终止的序列产生。如果这些序列进一步参与反应，产物将很难从混合序列中分

16、离出来。通过加帽，即将自由羟基乙酰化，解决了这个问题。乙酰化可由强的乙酰化试剂完成，该试剂是由等摩尔的醋酸酐和N-甲基咪唑组成，反应可在30秒内完成。氧化后，核苷酸加入，循环完成。寡核苷酸合成后，移去增长链5-末端的DMT基团，下一个核苷酸的聚合循环开始。整个寡核苷酸合成后，借助浓氨水的处理，寡核苷酸从固相载体上分离，同时碱基和磷酸基去保护。Q16. 标准寡核苷酸结构Q17. Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?合成量0.025 mol: 50 mer合成量0.05 合成量0.1 100 mer合成量0.2 合成量1.0 130 merQ18. 当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不

17、足50 nmol，为什么? 50 nmol的寡核苷酸合成不意味着能得到50 nmol的最终产品。50 nmol是指在寡核苷酸合成开始时固相载体负荷的数量。寡核苷酸通常是反应所要求的量而不是最终产率，用户得到的核苷酸的数量自然要比要求的少。终产率受寡核苷酸长度、碱基组成和连接效率的影响。Q19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗? 众所周知，含高百分比的“G”寡核苷酸不容易被合成，特别是序列中包含一行“G”。有报道，如果有四个或更多的“G”排成一行，寡核苷酸将趋向形成鸟嘌呤四聚体（Poon and MacGregor,Biopolymers, 1998, 45, 427 -434）。通过次黄嘌

18、呤核苷置换部分G，就能避免四聚体鸟苷的形成。Q20. 能提供寡核糖核酸（RNA）合成吗？ 是的，我们能合成。我们能提供2-OH或/和2-O-甲基结构的寡核糖核苷酸，也能合成由DNA和RNA组成的寡核苷酸。Q21. 合成的寡核苷酸在3位有磷酸基吗？ 如果没有殊要求,合成的寡核苷酸在3或5端均无磷酸基。如果你想要3有磷酸基的寡核苷酸，你应该在订单上标注清楚在3端进行磷酸化修饰。Q22. 简并引物及通用引物是什么？R - a 或 gY - c 或 tM - a 或 cK - g 或 tS - g 或 cW - a 或 tV - a, c或 gH - a, t或 cB - g, t或 cD - g,

19、a或 tN - a, c, g或 tQ23. 怎样纯化合成的寡核苷酸？ 为了纯化合成的寡核苷酸，Bioneer采取了几种不同的方法如，脱盐，BioRP, HPLC 及 PAGE。脱盐 寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-氰乙氧基-酸二脂键的保护基团以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所

20、有的非必需有机杂质，但它不能有效移除合成中产生的微量的（每个联结步骤中不超过2%）提前终止的寡核苷酸杂链。不过，脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究的。BioRP 如果寡核苷酸合成以“三苯甲基”的形式完成，则N末端包含5-DMT基团，而提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强亲脂性，有5-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂具有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用来进行寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5-DMT寡核苷酸间存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团这一原理，我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。HPLC 如果合成的寡核苷酸应

21、用于克隆，定向突变或定量的基因检测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，而HPLC纯化法被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸的纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35 mer）。PAGE 对于长的寡核苷酸的纯化（50-100 mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率（98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。Q24.用于芯片分析的60 mer寡核苷酸如何被纯化呢? 我们推荐PAGE纯化法用于60 mer寡核苷酸的纯化。通常，长核苷酸（大于50 mer）被推荐使用PAGE纯化法。Q25. 修饰寡核苷酸