125二羟维生素D3对屋尘螨香烟提取物所致气道上皮屏障损伤的保护作用及机制探讨Word文件下载.docx
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3<
）不但可以显著提高正常气道上皮细胞的跨膜电阻,也可以修复甲苯二异氰酸酯（TDI）所致的气道上皮屏障功能的破坏及连接蛋白E-cadherin的表达和分布异常,但其对慢性气道疾病常见危险因素（如尘螨、吸烟烟雾）损伤模型下的屏障保护作用和具体调控机制尚不完全明确。
屋尘螨（HDM）是哮喘最常见的过敏原之一,其通过破坏气道上皮细胞间连接,激活DC启动Th2免疫反应。
研究发现:
在哮喘的病理过程中,HDM可以刺激气道上皮细胞、巨噬细胞以及Th2细胞分泌产生VEGF,VEGF一方面参与形成气道和血管重塑等哮喘病理过程,另一方面又可反作用于气道上皮细胞介导炎症反应。
临床的相关研究甚至发现,VEGF水平的高低与哮喘的严重程度呈正相关关系。
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT通路作为各种免疫反应和炎症过程的经典通路,其可通过调控VEGF的表达调节气道上皮内高反应、炎症以及血管通透性。
同时相关研究已明确:
气道上皮内PI3K/Akt通路活化可上调VEGF表达,后者可加重上皮的损伤。
我们前期的实验也发现:
TDI和HDM可显著增加气道上皮通透性及VEGF的表达,而VEGF中和抗体可显著的抑制气道上皮的损伤;
VEGF单独作用即可破坏正常人支气管上皮细胞的屏障功能,利用PI3K抑制剂能显著降低VEGF的表达及气道上皮的损伤。
由此可见,在气道上皮损伤的病理过程中,PI3K/VEGF通路确实与上皮细胞屏障损伤相关,同时维生素D还可以显著降低TDI诱导的气道上皮细胞VEGF和VEGFmRNA的表达。
基于上述实验结果,我们猜想:
在HDM诱导气道上皮损伤的病理过程中,PI3K/Akt通路参与了VEGF表达的调控,同时1,25（OH）<
可通过PI3K/Akt通路下调VEGF的表达,从而发挥保护上皮屏障的作用。
慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydisease,COPD）是一种以持续性气流受限为特征的慢性气道疾病,与气道和肺脏对有害气体及有毒颗粒的异常炎症反应有关,致残率和病死率很高,全球40岁以上发病率已高达9%～10%。
COPD的确切病因尚不清楚,已经发现的危险因素大致可以分为外因（即环境因素）与内因（即个体易患因素）两类。
外因包括吸烟、粉尘和化学物质的吸入、空气污染、呼吸道感染等。
内因包括遗传因素、气道反应性增高者等。
其中吸烟烟雾是COPD最常见的危险因素之一。
现研究普遍认为,吸烟烟雾与COPD,哮喘,支气管炎等慢性呼吸道疾病相关。
研究证实,香烟提取物（CSE）可通过促钙激活中性蛋白酶（calpain）活化,剪切上皮细胞连接蛋白,破坏气道上皮间的连接,导致上皮功能障碍并激发粘膜下层的病理性改变,使气道上皮下组织长期处于应激及炎症状态,最终导致慢性呼吸道疾病的发生和进展。
由此可见,calpain激活是CSE诱导气道上皮屏障损伤的途径之一。
calpain是钙离子活化的半胱氨酸蛋白酶,基本在所有组织中均有表达,其活性主要受MAPK通路调控。
最近研究表明,维生素D可以抑制calpain活化后E-cadherin裂解所导致的胆道上皮损伤。
因此,我们假设:
在CSE诱导气道上皮损伤的病理过程中,MAPK通路参与了calpain活化的调控,同时1,25（OH）<
可通过MAPK通路下调calpain的表达,从而发挥保护上皮屏障的作用。
本课题拟在体外实验探讨:
1.HDM诱导的气道上皮屏障破坏与VEGF、PI3K/Akt通路之间的关系;
2.1,25（OH）<
是否可以抑制HDM诱导的气道上皮屏障破坏?
其作用机制是否与VEGF、PI3K/Akt通路有关?
3.进一步明确气道上皮损伤病理过程中,PI3K/Akt通路的活化与VEGF表达之间的关系。
4.在CSE诱导的气道上皮屏障破坏中,进一步明确1,25（OH）<
是否可以抑制CSE诱导的气道上皮屏障破坏?
其作用机制是否与MAPK通路调控的calpain活化有关?
方法:
1.培养正常人支气管上皮细胞株16HBE及BEAS-2B。
将细胞接种在含10-15%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中,培养皿平放置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养。
当细胞融合至90%-95%后,消化后用细胞计数板计数,按2.5×
104/cm2的密度将细胞按实验需要的密度接种于所需培养皿中,用于下一步实验。
本实验均使用3-10代以内的支气管上皮细胞,以避免细胞老化对实验结果的影响。
2.MTT比色法检测各种浓度的干预因素处理后的支气管上皮细胞的活力3.观测1,25（OH）<
对HDM导致对气道上皮细胞屏障功能的修复作用。
实验分4组:
①正常对照组;
②HDM组（400U/mL,处理24小时）;
③1,25（OH）<
单纯处理组（10nM,处理24小时）;
④1,25（OH）<
预处理组（1,25（OH）<
预处理后予HDM作用）。
屏障功能评价指标主要有:
1）细胞跨膜电阻（TEER）用Millicell电阻仪进行测定,求得标准化电阻值。
异硫氰酸萤光素（FITC）-右旋糖酐透过率（Pa）用于研究单层细胞通透性的变化,实验结果均以Pa/对照组PaX100%表示。
2）WesternBlot法检测支气管上皮细胞粘附连接蛋白（E-cadherin,β-catenin）及紧密连接蛋白（Occludin,ZO-1）的表达水平,用图像处理软件分析连接蛋白/内参蛋白条带灰度值及其比值。
3）细胞免疫荧光法检测支气管上皮细胞连接蛋白（E-cadherin,β-catenin,Occludin和ZO-1）的分布情况。
4.观察1,25（OH）<
对HDM促进VEGF释放的抑制情况及PI3K/Akt通路在此过程中的作用。
实验分组:
②HDM组;
单纯处理组;
WesternBlot法检测磷酸化Akt（Thr308和Ser473位点）及VEGF蛋白表达水平;
实时定量荧光PCR用于检测VEGFmRNA表达,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞上清中的VEGF释放水平。
5.为进一步评价PI3K/Akt通路在促进上皮细胞释放VEGF及损伤上皮屏障中的作用,并证实1,25（OH）<
经PI3K/Akt通路下调VEGF释放,从而发挥气道上皮屏障保护的功能。
分别在支气管上皮细胞株16HBE和BEAS-2B细胞予PI3K通路抑制剂LY294002及PI3K通路激动剂IGF-1进行验证,实验分6组:
③LY294002单纯处理组（50μM,处理1小时）;
④LY294002预处理组（LY294002预处理后予HDM作用）;
⑤IGF-]单纯处理组（100ng/ml,处理24小时）;
⑥IGF-1预处理组（IGF-I预处理后予1,25（OH）<
作用）。
细胞跨膜电阻及FITC-右旋糖酐透过率用于评估气道上皮屏障功能;
实时定量荧光PCR和ELISA法分别用于检测VEGFmRNA表达及细胞培养上清VEGF释放水平。
6.进一步验证1,25（OH）<
对VEGF导致的气道上皮屏障破坏的保护作用。
16-HBE细胞在实验中分成四组:
②VEGF组;
预处理后予VEGF作用）。
评价气道上皮屏障功能（方法同3）;
WesternBlot法检测磷酸化Akt（Thr308和Ser473位点）蛋白表达水平,用图像处理软件分析磷酸化Akt蛋白（Thr308和Ser473位点）/总Akt蛋白条带灰度值及其比值。
7.验证1,25（OH）<
对CSE导致的气道上皮屏障破坏的保护作用。
②CSE组;
预处理后予CSE作用）。
WesternBlot法检测上皮连接蛋白（E-cadherin和b-catenin）,钙蛋白酶-1（calpain-1）和MAPK通路相关蛋白（ERK,JNK,和p38）磷酸化的表达水平,用图像处理软件分析蛋白条带灰度值。
8.应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料用均数±
标准差（x±
s）表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析（one-wayANOVA）,各组间多重比较采用Bonferroni法;
方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用DurnnettT3检验。
实验单位为两个及以上因素多水平测量时,数据使用析因设计的方差分析,两样本均数比较用两样本t检验,P&
lt;
0.05为具有统计学意义。
结果:
1.不同浓度的1,25（OH）<
和HDM对支气管上皮细胞系16HBE和BEAS-2B细胞活力影响:
1,25（OH）<
（100nM及以下浓度）和HDM（600U/mL及以下浓度）对细胞活力无显著影响（均P&
gt;
0.05,n=6）。
可部分修复HDM所致的气道上皮屏障的破坏:
与对照组比较,HDM（400U/mL,处理24小时）可导致人支气管上皮细胞16HBE和BEAS-2B单层细胞TEER显著下降（t=9.016,P=0.001和t=36.366,P=0.000）,和FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）显著增加（t=-4.022,P=0.016和t=-4.657,P=0.010）;
E-cadherin及ZO-1表达水平减少。
细胞免疫荧光显示HDM可促进正常分布于细胞膜的连接蛋白（E-cadherin,β-catenin,Occludin和ZO-1）连续性及完整性破坏,并向胞浆弥散。
而予1,25（OH）<
预处理后,可修复HDM所致电阻值（t=11.750,P=0.020和t=17.000,P=0.000）和FITC-右旋糖苷通透性（t=-3.355,P=0.028和t=-3.615,P=0.022）改变,并逆转连接蛋白表达和分布的异常。
3.1,25（OH）<
可抑制HDM所致的VEGF释放及磷酸化Akt高表达:
WesternBlot结果显示,HDM作用可使人16HBE和BEAS-2B细胞系VEGF表达增高,Akt（Thr308和Ser473位点）的磷酸化增强（PT308=0.018,Ps473=0.013和PT308=0.012,PS473=0.011）,与正常对照组比较有统计学差异。
予1,25（OH）<
预处理后可降低VEGF的高表达（P=0.000）并降低Akt磷酸化水平（PT308=0.012,Ps473=0.016和Pr308=0.042,Ps473=0.011）,与HDM组比较有统计学差异。
与之相对应,实时定量荧光PCR和ELISA结果显示,与正常对照组比较,HDM可显著增加VEGFmRNA表达（t=-11.078,P=0.000和t=-17.662,P=0.000）及VEGF释放（t=-17.902,P=0.000和t=-53.445,P=0.000）,而1,25（OH）<
预处理后可部分逆转这一过程（t=-14.025,P=0.000和t==-20.313,P=0.000）。
4.1,25（OH）<
经PI3K/VEGF途径参与修复HDM导致的气道上皮屏障破坏:
在16HBE和BEAS-2B细胞系,PI3K通路激动剂IGF-1（100ng/ml）单纯处理24小时后,TEER显著降低（P=0.000和P=0.000）,FITC-右旋糖酐透过率显著升高（P=0.000和P=0.014）,VEGFmRNA表达（P=0.003和P=0.004）及VEGF释放增加（P=0.000和P=0.000）,与正常对照组比较有统计学差异（P&
0.01）。
与IGF-1单纯处理组比较,1,25（OH）<
预处理后TEER显著回升（P=0.001和P=0.000）,FITC-右旋糖酐透过率显著降低（P=0.002和P=0.019）,VEGFmRNA表达及VEGF释放减少（P=0.000和P=0.000）,差异有统计学差异。
与HDM组比较,PI3K通路抑制剂LY294002（50μM）预处理1h可显著逆转这一结果,有统计学差异（P=0.000和P=0.000）。
5.1,25（OH）<
修复VEGF所致的气道上皮屏障破坏:
与VEGF组比较,1,25（OH）<
预处理后可修复VEGF所致的TEER降低（t=8.600,P=0.001）和FITC-右旋糖酐通透性增高（t=-5.361,P=0.006）。
VEGF与1,25（OH）<
对支气管上皮细胞连接蛋白的表达量没有影响。
细胞免疫荧光结果示VEGF作用后可以使沿细胞膜分布的连接蛋白绿色荧光减弱,结构疏松甚至出现连续性破坏,且绿色荧光在细胞浆中弥散增多;
（10nM,处理24小时后加VEGF刺激）预处理后,可部分修复VEGF所致的连接蛋白分布异常。
WesternBlot结果显示,1,25（OH）<
预处理后可降低VEGF所致的Akt（Thr308和Ser473位点）磷酸化水平增高,与VEGF组比较有统计学差异（P=0.030和P=0.000）。
6.不同浓度的CSE对支气管上皮细胞系16HBE细胞活力影响:
CSE（2.5%及以下浓度）对细胞活力无显著影响（P&
7.1,25（OH）<
可部分修复CSE所导致的气道上皮屏障的破坏:
与对照组比较,2.5%CSE可导致人支气管上皮细胞16HBE单层细胞TEER显著下降（t=6.930,P=0.002）,和FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）显著增加（t=-12.954,P&
0.001）;
黏附连接蛋白E-cadherin及b-catenin表达水平减少。
细胞免疫荧光显示CSE可促进正常分布于细胞膜的连接蛋白（E-cadherin和β-catenin）连续性及完整性破坏,并由胞膜向胞浆移位。
预处理后,可修复CSE所致电阻值（t=-4.323,P=0.012）和FITC-右旋糖苷通透性（t=-3.629,P=0.022）改变,并逆转连接蛋白（E-cadherin和β-catenin）表达和分布的异常。
8.1,25（OH）<
可抑制CSE所致的calpain-1表达及ERK磷酸化水平高表达:
WesternBlot结果显示,CSE作用可使人16HBE细胞系calpain-1表达增高,MAPK通路（ERK,P38和JNK）的磷酸化增强,与正常对照组比较有统计学差异（均P&
0.05）。
预处理后可降低calpain-1的表达及ERK磷酸化水平,与CSE组比较有统计学差异（均P&
9.1,25（OH）<
经ERK/calpain-1途径参与修复CSE导致的气道上皮屏障破坏:
在16HBE细胞系,ERK通路抑制剂U0126（10uM）和calpain-1抑制剂ALLM（10nM）可降低CSE诱导的TEER降低,FITC-右旋糖酐透过率显著升高和calpain-1的高表达,与CSE组比较有统计学差异（均P&
同时,ERK通路抑制剂U0126还能抑制CSE诱导的ERK磷酸化水平,与CSE组比较有统计学差异（P&
结论:
1.1,25（OH）<
可修复HDM所导致的气道上皮屏障功能的破坏。
表现为1,25（OH）<
部分抑制HDM所致的跨上皮细胞电阻值（TEER）下降,FITC-右旋糖苷通透性增加,连接蛋白（E-cadherin及ZO-1）表达降低和连接蛋白（E-cadherin,β-catenin,Occludin及ZO-1）分布的异常。
HDM可通过促进VEGF的高表达及其上游主要调节通路PI3K/Akt的激活破坏气道上皮屏障,1,25（OH）<
可通过抑制这一途径发挥屏障保护的功能。
可减轻外源性VEGF所导致的气道上皮屏障功能的破坏。
可修复CSE所导致的气道上皮屏障功能的破坏。
部分抑制CSE所致的TEER下降,FITC-右旋糖苷通透性增加,连接蛋白（E-cadherin和β-catenin）表达降低及分布的异常。
CSE可通过促进calpain-1的高表达及激活其上游主要调节途径MAPK通路破坏气道上皮屏障。
可下调ERK/calpain-1通路发挥屏障保护功能。
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