北京市地铁拉环和扶杆表面细菌的检测与鉴别Word文档格式.docx
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参考《中华人民共和国国家标准-医院消毒卫生标准GB15982－1995》关于对物体表面细菌菌落总数卫生标准的相关规定，认为北京市地铁虽然有细菌存在，但细菌菌落总数比较少，对公众健康不构成威胁；
但仍存在少量的肠道细菌，应该引起重视。
英文摘要
RecoveryofBacteriafromInteriorHandlesandHandrailsoftheBeijingSubwaySystem
XULingzi∆,YANYujing∆,XUGuoheng,LUfengmin*
∆HighSchoolAffiliatedtoRenminUniversityofChina
*DepartmentofMicrobiology,BeijingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China.
*Correspondingauthor
BackgroundContaminationofmicroorganismsinpublicplacesisapotentialpublichealthhazard.Bacterialcontaminationmayoccurthroughdirectcontacttocontaminatedsurfaces.ThesubwaysysteminBeijingisuseddailybythousandsofcommutersandtravelers.Manypassengersusethehandrailsandhandlesforstandingsupport,whichmaycausespreadofbacteriaandotherpathogens.Inthisstudy,weexaminedbacterialdistributiononhandrailsandhandlestoevaluatethepotentialhealthrisksofmicrobiologicalcontaminationintheBeijingsubwaysystem.
MaterialsandMethodsAtotalof122sampleswerecollectedfromthesurfaceofhandrailsandhandlesinBeijingsubwayline-2cars.Thesurfacewaswipedfourtimeswithsterilecottonswabspre-wetwithsterilesaline.SampleswereincubatedonstandardbeefbrothagarandMacConkey’sagarfor48hoursat37º
C.Beefbrothagargrowsallbacteria;
MacConkey’sagaronlyallowsgrowthofGram-negativebacteriaandidentifiesthemforlactosefermentation.
ResultsTheaveragenumberoftotalbacteriawas8.9cfu/cm2（bacterialcolonyformingunitspercm2）onhandles.TheaveragecountofGram-negativebacteriaonhandleswas3.9cfu/cm2,whichincludes2.1cfu/cm2lactose-fermentingbacteriaand1.8cfu/cm2non-lactosefermentingbacteria.Incontrast,theaveragetotalbacteriaonhandrailswas7.1cfu/cm2,including1.9cfu/cm2G-bacteria.Therewasnodistinctdifferenceinbacterialcountbetweenweekdaysandweekends.
ConclusionThecontaminationlevelofallbacteriaaswellasGram-negativecoliformbacteriaisrelativelylowonthehandlesandhandrailsinBeijingsubway,andthereforedoesnotpresentahighhealthriskforpassengers.
自然界的细菌按致病性可以分为致病菌和非致病菌两大类。
致病菌可导致人类和动物发生各种感染性疾病或传染病。
非致病菌通常不导致广泛存在于自然界和正常人体。
正常人的体表和体内消化系统寄生着许多细菌，通常对人不致病，称为人体正常菌群；
当其寄生部位改变、机体抵抗力降低或肠道菌群失调时则可致病。
按照细菌对革兰氏染色（Gram’sstaining）的反应，还可以将细菌分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。
革兰氏阴性细菌多来自肠道，并可进一步分为乳糖发酵细菌和非乳糖发酵细菌。
环境中这类细菌的含量与环境卫生程度有关，并可指示是否有潜在的来自肠道的病原微生物，因此常将此类细菌作为监测环境卫生的指标。
人类及其日常活动，是公共场所细菌的主要来源，也是传播细菌的主要媒介[1-5]。
公共场所和公共设施与社会大众的日常生活密切相关。
北京是中国的政治、经济和文化中心，交汇来自全国各地、世界各地的人们。
北京市地铁客流量大，人员杂，仅2006年运输人次达7.7亿（数字来自北京市政府官方网站）。
成千上万的地铁的乘客每天在北京市的地铁交汇，并转向北京和全国各地。
伴随着人的活动，特别是一些带有特定病原细菌的乘客的活动，各种细菌也容易在地铁处交汇。
因此，监测北京市地铁固体表面细菌总数和分类，有助于明确北京市地铁系统的清洁卫生情况，为公众提供健康安全的第一手资料。
为此，本研究检测北京市地铁二号线列车车厢内的拉环和扶杆上的细菌污染情况。
材料与方法
地铁车厢表面细菌样品采集
样品选取：
为了尽可能保证所取样品测定值之间的可比性，选取北京市地铁二号线顺时针方向运行列车取样。
每一车厢内取样的位置相对稳定。
拉环：
北京市地铁二号线顺时针方向运行的旧式列车车厢内拉环。
对于三门车厢，从前数（以列车前进方向为前）第二个门前方左边第4个拉环取样。
对于四门车厢，从前数第三个门前方左边第4个拉环取样。
分4次取样，取样时间分别为2008年4月4日上午（星期五）、4月10日全天（星期四）、4月13日上午（星期日）、4月20日上午（星期日）。
共取得122个有效样品。
每个拉环及其所取样品做标号记录。
扶杆：
北京市地铁二号线顺时针方向运行的新式列车车厢内，位于门旁后方的竖直扶杆。
取样时间为2008年4月27日上午（星期日）。
共取得22个有效样品。
每个扶杆及其所取样品做标号记录。
取样方法和过程
样品采集所需的生理盐水、棉拭子、离心管等所有材料，均预先进行高压蒸气灭菌20－30分钟。
每个拉环手触部分面积为60cm2，全部取样。
用两个浸有无菌生理盐水采样液的消毒棉拭子先后在检测部位各表面往返各涂抹4次,并随之转动棉拭子（依据医院消毒卫生标准）。
两个拭子可提高细菌检测效率，参见文献[1,6]。
由于所测部位上、下两表面形状稍有倾斜，第一次将上、下表面当作两个平面处理，即上下分别往返各涂抹8次；
第二次将其当作一个平面处理，即各涂抹4次。
两支拭子以管口为支点折断手触部分后放入同一个装有3ml生理盐水的试管，暂时放入盛有冰的冰盒内保存，以减少取样后细菌的分裂增殖。
取样结束后立即送于实验室，涂于培养皿中培养。
培养基和细菌培养方法
牛肉膏琼脂培养基：
革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均可生长，用于细菌总数测定。
成分如下：
蛋白胨10g，
牛肉膏5g，
氯化钠5g
琼脂17g
蒸馏水1000ml
高压蒸气灭菌后于无菌超净工作台中倒入玻璃培养皿内。
麦康凯琼脂培养基：
又称MacConkey琼脂，为购自公司预混合好的培养基。
麦康凯培养基内含胆盐和结晶紫，能抑制革兰氏阳性菌生长，是革兰氏阴性细菌的选择性培养基。
同时培养基中含乳糖和中性红指示剂，依据细菌能否发酵乳糖产生乳酸，可将肠道菌群分为两大类。
pH≤6.8时菌落为红色，pH>
6.8时菌落为白色或黄色。
因此，能分解乳糖产生乳酸的菌落，如大肠杆菌菌落，其周围pH值降低因而菌落为红色。
红色菌落的细菌，既有非致病菌，也有致病菌。
不能分解乳糖的菌落为白色，包括沙门氏菌，痢疾杆菌、伤寒和副伤寒杆菌，通常为致病菌。
麦康凯培养基高压蒸气灭菌后于无菌超净工作台中倒入玻璃培养皿内。
细菌培养方法
将每一个样品的拭子，折断手触部分放入装有3ml生理盐水的试管中，在振荡器上剧烈振荡5秒，使细菌均匀分散于生理盐水中。
按照无菌操作原则，于无菌超净工作台中操作。
分别取0.3ml菌液样品涂布于牛肉膏培养基培养皿和麦康基培养基培养皿上，标号。
在无菌超净台内等待培养皿内的液体吸收干净，将培养皿放入37º
C细菌恒温培养箱培养48小时。
细菌计数方法
培养48小时后，对培养皿进行菌落计数。
对于每一样品，在牛肉膏培养基平板上生长的菌落，计为细菌总数；
在麦康基培养基平板上的菌落，计为革兰氏阳性菌落总数。
同时，根据麦康基培养基上菌落及周边培养基的颜色，将革兰氏阴性菌落分为红色的乳糖发酵菌，和白色的非乳糖发酵菌，进行分类计数。
少数培养皿上有大片真菌生长，或局部有大量细菌密集生长在一起，影响准确计数，此类平板弃去不作计数[2,4,5]。
结果与讨论
不同培养皿上生长的菌落及鉴别图示
以下照片显示用于细菌总数检测的牛肉膏培养基平板的菌落，和用于革兰氏阴性细菌检测与鉴别的麦康基培养基平板的菌落。
其中在麦康基培养基平板的菌落呈红色的菌落，为乳糖发酵细菌，呈白色菌落的为非乳糖发酵细菌。
1．地铁拉环表面的细菌总菌落数
表1.
不同时间监测地铁拉环表面的细菌总数
菌落范围
（单位：
菌落/拉环）
（4月4日
星期五）
拉环个数
（4月10日
星期四）
（4月13日
星期天）
（4月20日
拉环总数
占拉环总数百分比
0－0
2
1
3
3%
1－100
16
6
25
23%
101－200
5
9
20
18%
201－300
4
12
11%
301－400
401－600
8
13
12%
601－800
7
6%
801－1000
5%
1000－2500
2500以上
拉环数
15
31
34
30
110
100%
注：
每个拉环手触部分面积为60cm2。
图1.
拉环表面总细菌分布情况
地铁拉环表面细菌检测结果分析:
对于细菌总数检测，我们总计取了122个拉环的细菌样品，有效拉环样品共110个。
其中有3个拉环未检测出细菌污染。
总细菌数目在1~100个的范围内的拉环最多，有25个。
大约72%的拉环上的总细菌数目小于500个，按照每个拉环的取样面积60cm2计算，即小于8.3cfu/cm2（colonyformingunitpercm2）。
细菌数目超过1000个，即大于16.7cfu/cm2的拉环总计有12个，占总数的11%。
《中华人民共和国国家标准-医院消毒卫生标准》规定医院普通病房、换药治疗室可允许的总细菌数少于<
10cfu/cm2，即每平方厘米少于10个细菌[7]。
地铁拉环表面总细菌数多小于这一值，因此可以认为地铁总细菌含量相对较少，对公众安全不构成威胁。
检测结果分别来自四天的取样。
这4天分别是周四、周五和周日，对应于工作日和周末的不同客运流量。
从结果看，不同日期拉环上的细菌分布情况有较大波动，但这种波动似乎并未显现出特殊的规律，表明在工作日和周末，虽然营运时间不同，乘客数量和类型不同，但这些因素对北京地铁拉环表面的细菌数量没有明显影响。
2．地铁拉环表面的革兰氏阴性菌总数测定及其鉴别
图2.
拉环表面革兰氏阴性细菌分布情况
图3.
拉环表面发酵乳糖的革兰氏阴性细菌分布情况
图4.拉环表面不发酵乳糖的革兰氏阴性细菌分布情况
对拉环表面的革兰氏阴性菌总数测定及其鉴别结果的分析:
麦康凯（MacConkey）培养基含有抑制革兰氏阳性菌生长的胆盐和结晶紫染料，有利于革兰氏阴性细菌生长；
并且含乳糖和中性红指示剂，pH≤6.8时菌落为红色，pH>
6.8时菌落为白色或黄色，能够鉴别产乳酸菌和不产乳酸细菌。
依据细菌能否发酵乳糖产生乳酸，可将肠道菌群分为产乳酸菌和不产乳酸细菌两大类。
能分解乳糖产生乳酸的细菌菌落，其周围pH值降低因而菌落为红色。
常见的产乳酸菌有埃希氏大肠杆菌（Escherichiacoli）,肠杆菌（Enterobacter）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）等。
产乳酸的革兰氏阴性菌，常用来指示肠道细菌的存在，表明可能存在肠道病原污染，其中既有非致病菌，也有致病菌，或在某些特定条件下致病的条件致病菌如肺炎克雷伯氏菌。
不能分解乳糖产生乳酸的细菌菌落为白色，有沙门氏菌和志贺氏菌，如痢疾杆菌、伤寒和副伤寒杆菌，通常为致病菌。
根据麦康凯培养基检测结果，在122个有效拉环样品中，检测到120个拉环存在阴革兰氏性菌，占98.4%。
存在1－50个革兰氏阴性菌的拉环有46个，占总数的38%。
相对于每个拉环60cm2的取样面积，每平方厘米内平均细菌少于1个。
发现产乳酸菌和不产乳酸的样品均有106个。
有39%的拉环产乳酸细菌数目在50个以下，56%的拉环产乳酸菌数目在100个以下。
地铁拉环普遍存在少量革兰氏阴性细菌，多数存在能发酵乳糖的肠道细菌。
这说明地铁拉环存在一定的来自肠道的细菌污染，但数量不多。
因为拉环上的细菌不被直接摄入体内，少量这类细菌可能不对公众安全构成威胁。
但少量肠道细菌的存在，表明拉环表面存在一定程度的人类肠道细菌的污染，其对乘客健康具有潜在的不利影响，应该引起重视，加强地铁车厢内部卫生清洁工作。
3．扶杆表面细菌总数检测结果
表2.
扶杆表面细菌情况（cfu/cm2）
菌落范围（单位：
（细菌总数）
（革兰氏阴性菌）
（发酵乳糖菌）
（不发酵乳糖菌）
11
1－5
14
6－10
10－15
15以上
图5.扶杆表面总细菌分布
图6.扶杆革兰氏阴性细菌分布
图7.扶杆表面乳糖发酵菌与非乳糖发酵细菌分布
扶杆表面细菌检测结果分析：
地铁扶杆有81%检测到细菌存在，分别有45%、40%、25%检测到革兰氏阴性菌、产乳酸细菌和不产乳酸细菌，41个培养皿中有18个发现霉菌的存在，占44%。
各类细菌含量均较少。
因此北京市地铁扶杆细菌含量相对较少。
4．拉环和扶杆表面的平均细菌分布
表3.拉环和扶杆表面的平均细菌分布
拉环表面细菌分布
扶杆表面细菌分布
单位面积平均细菌总数cfu/cm2
8.9
7.1
单位面积平均革兰氏阴性菌总数cfu/cm2
3.9
1.9
平均细菌总数
532.4
－
平均革兰氏阴性菌总数
232.3
平均乳糖发酵菌数
2.1
0.8
平均非乳糖发酵菌数
1.8
革兰氏阴性菌占总数比例
47.00%
20.20%
拉环和扶杆表面的平均细菌分布的结果分析
北京市地铁二号线拉环平均细菌含量为8.9cfu/cm2，革兰氏阴性菌含量为3.9cfu/cm2，每处革兰氏阴性菌占该处总细菌的比例平均为47%。
扶杆平均细菌含量为7.1cfu/cm2，革兰氏阴性菌含量为1.9cfu/cm2，阴性菌占总细菌的平均比例为20.2%。
相比之下，2005年一项调查中发现美国华盛顿等两个城市办公桌平均细菌含量为777cfu/cm2，办公电话细菌含量866个/cm2，键盘平均每平方厘米检测到584个细菌[8]。
另外，我国医院消毒卫生标准规定医院普通病房、换药治疗室可允许的总细菌数少于<
地铁拉环表面总细菌数多小于这一值，据此认为北京地铁拉环和扶杆表面总细菌含量相对较少，对公众安全不构成威胁。
然而值得注意的是，第一，虽然北京市地铁卫生状况总体尚好，但有个别拉环和扶杆表面细菌总数很多；
第二，北京地铁拉环和扶杆表面仍然普遍存在少量革兰氏阴性细菌，多数存在能发酵乳糖的肠道细菌。
这说明地铁拉环存在一定的来自肠道的细菌污染，虽然数量不多，但可能对乘客健康有潜在的不利影响，应该引起地铁管理部门和乘客的重视，加强地铁车厢内部卫生清洁工作，并建议乘客下车后洗手，不要直接用手接触食物。
结论
采集北京市地铁二号列车内拉环和扶杆表面细菌有效样品144个。
培养检测细菌总数、革兰氏阴性细菌数、乳糖发酵和非乳糖发酵细菌数。
研究结论如下：
1．工作日和周末的营运时间、乘客数量、乘客类型不同，但这些因素对北京地铁拉环表面的细菌污染数量没有明显影响。
2．以每平方厘米细菌个数表示，拉环表面总细菌数有8.9个；
革兰氏阴性细菌有3.9个，其中乳糖发酵细菌2.1个，非乳糖发酵细菌1.8个。
扶杆表面总细菌数7.1个；
革兰氏阴性菌有1.9个。
3．参考《中华人民共和国国家标准-医院消毒卫生标准GB15982一1995》关于对物体表面细菌菌落总数卫生标准的相关规定，认为北京市地铁虽然有细菌存在，但细菌菌落总数比较少，对公共健康不构成威胁；
致谢
感谢北京青少年科技科技俱乐部、北京大学医学部和中国人民大学附属中学，使我在高中阶段就能体验生物科学研究的乐趣。
感谢北京大学医学部鲁凤民教授和徐国恒教授提供试验仪器，指导设计实验和数据处理。
感谢人大附中的范克科老师对课题的有益讨论。
参考文献：
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