基因工程jilyWord格式.docx
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SSR：
简单重复序列多态性，也叫微卫星标记，其串联重复的核心序列为2-6bp，多态性片段长度约100-300bp。
AFLP：
扩增片段长度多态性,它结合了RFLP和PCR技术特点，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。
PCR：
聚合酶链式反应，模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
探针：
指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。
基因芯片：
通过微阵列技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或在位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片或硅征等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。
基因治疗：
是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也包括剔除或抑制某些导致疾病的基因），从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。
基因打靶：
是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
基因疗法：
利用健康的基因来填补或替代基因疾病中某些缺失或病变的基因。
核酸分子杂交：
具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。
原位杂交：
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
分子标记：
是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。
简答题
1.质粒作为理想的基因工程载体应具备哪些特点？
（1）一个复制起点
（2）可选择的标记，是鉴定细胞是否携带载体所必需的。
（3）合成的单一限制酶酶切位点
（4）插入标记，是用来观察外源基因是否插入。
（5）合适的大小，质粒应该相对的小，小质粒不易受物理损伤，而且限制酶的（6）酶切图谱较简单，另外，小质粒一般具有较高的拷贝数。
（6）高拷贝数，基因工程应该选择具有高拷贝数的松弛型的质粒为载体。
不同的质粒有不同的拷贝数
（7）不易丢失
2.在提取DNA的过程中，用无水乙醇和异丙醇均可沉淀DNA有什么区别？
在提取DNA的过程中，利用无水乙醇和异丙醇均可沉淀DNA，但它们之间是有区别的：
沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全，而且沉淀的多数是大片段的DNA。
利用冰冷的异丙醇（一般用等体积）也可沉淀DNA，而且沉淀速度快，沉淀完全，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
3.在碱法提取质粒的过程中应注意哪些问题？
（1）整个过程都需要在低温下操作
（2）加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。
（3）在提取的过程中应该保持动作温和，不要剧烈振荡
（4）提取过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
4.与其他转基因方法相比，基因枪法有哪些优点？
（1）无宿主限制
（2）靶受体类型广泛
（3）可控度高（4）操作简便快速，甚至可克服无菌的困难
5.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为可能是什么原因。
（1）所加的限制性酶已失活，
（2）DNA片段结构的特殊性，对酶要求高，或相对应的酶切位点很少
（3）电泳时所加的电极缓冲液的离子强度太大使DNA分离不明显，或者是离子强度太小，使DNA没有泳动。
（4）琼脂糖的浓度没有控制好，
（5）有外来DNA的污染
6.基因工程的研究内容是什么？
▲
基础研究：
（1）基因工程克隆载体的研究；
（2）基因工程受体系统的研究；
（3）目的基因的研究；
（4）基因工程工具酶的研究；
（5）基因工程新技术的研究；
（6）特定目的基因的分离或合成；
（7）构建重组DNA分子；
（8）转化宿主细胞；
（9）筛选重组DNA菌落；
（10）目的基因的有效表达。
应用研究：
基因工程已在医药业、农牧业、食品工业、环境保护、能源开发等领域重到了广泛的应用。
7.基因组文库与cDNA文库有何区别？
基因组文库是指含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
cDNA文库是指从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。
cDNA文库与基因组文库的主要差别是：
（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；
（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；
cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响；
（3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；
而eDNA克隆的是不含内含子的基因。
8.PCR引物设计的原则是什么？
（1）引物长度应在15～30bp，Tm接近72℃较佳。
（2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。
（3）GC碱基的含量在45%～55%。
（4）两个引物在3′端均必须与模板互补，5′端可以不互补。
（5）引物自身连续互补碱基小于4个。
（6）引物之间连续互补碱基小于4个。
9.基因工程操作要求受体细胞应该具备哪些特点？
（1）转化率高；
（2）保持质粒稳定；
（3）营养缺陷型；
（4）其他标记
不同的实验目的，使用不同的载体和受体细胞。
10.简述农杆菌介导的基因转化的特点及其在基因转化过程中的影响因素？
特点：
（1）转化频率高；
（2）导入植物细胞的片段确切，且能导入大片段的DNA；
（3）导入基因拷贝数低，表达效果好；
（4）农杆菌转化方法使用的技术、仪器简单。
影响因素：
（1）不同属性农杆菌对转化的影响；
（2）植物基因型及外植体对转化的影响；
（3）再生植株的细胞起源对转化的影响；
（4）培养方法对转化的影响；
（5）不同选择药物对转化效率的影响。
11.植物基因转化受体建立中常常会遇到哪些问题？
（或者是要考虑的因素）
（1）是否具有稳定的外植体来源；
（2）是否具有高效稳定的再生能力；
（3）是否具有较好的遗传稳定性；
（4）是否对选择性抗生素敏感。
12.基因工程的基本操作程序包括哪几部分内容？
（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA包括（外源基因或目的基因）和载体分子切开（“切”）
（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（“接”）
（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（“转”）
（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（“增”）
（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（“检”）
13.影响凝胶电泳的因素有哪些？
（1）凝胶浓度：
凝胶的浓度取决于DNA的分子大小。
（2）DNA的分子大小与构象：
当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动的距离不仅与DNA的分子量有关，还和它本身构象有关。
（3）电泳缓冲液：
TAE缓冲液的缓冲能力较低，适用于低电压长时间电泳；
TBE有较强的缓冲能力，是比较通用的缓冲液。
（4）指示剂：
溴酚蓝，呈蓝紫色；
二甲苯腈，呈蓝色。
（5）染色：
用溴化乙啶进行染色。
14.限制性内切酶的活性受哪些因素影响？
（1）酶的纯度；
（2）DNA样品的浓度；
（3）DNA甲基化的程度；
（4）酶切反应的温度与时间；
（5）DNA的分子构型；
（6）反应缓冲液。
15.理想的分子标记必须达到的要求是什么？
（1）高多态性；
（2）共显性遗传；
（3）能明确辨别等位基因；
（4）遍布整个基因组；
（5）无基因多效性；
（6）检测手段简单快速；
（7）成本低廉；
（8）重复性好。
16.CTAB和SDS法提取核酸的原理各是什么？
CTAB法：
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的；
当降低溶液盐浓度到一定程度时从溶液中沉淀，通过就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开；
然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。
SDS法：
其原理是利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠）在较高温度（55-65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀。
离心除去沉淀后，对上清液中的核酸进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。
17.如何对转基因植株进行检测？
（1）形态学鉴定
（2）分子生物学鉴定
选择标记基因；
选择和基因分离分析方法来鉴定转化植株；
确定外源DNA整合的基因位点的数目；
确证转化植株的分子生物学技术。
（3）细胞学鉴定：
荧光原位杂交。
18.制备目的基因片段的途径有哪些？
（1）从生物基因组群体中分离目的基因；
（2）人工合成；
（3）PCR反应合成DNA；
（4）mRNA差异显示法获得目的基因；
（5）机械的方法如超声波把基因组打成片段
19.列举质粒载体必须具备的几个基本特性。
（1）具有复制起点。
（2）携带易于筛选的选择标记。
（3）具有多种限制性内切酶的切割位点。
（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数
20.几种核酸杂交技术的区别。
Southern杂交
Northern杂交
Western杂交
分析检测对象
DNA
RNA
蛋白质
电泳
DNA电泳
RNA电泳
SDS-PAGE电泳
转膜
需变性
不需变性
检测方法
银染、生物素、荧光等处理
化学发光法、化学显色法
免疫学、酶促反应（显色反应）
21.分子标记有哪几种类型？
（1）以分子杂交为核心的分子标记：
RFLP；
VNTR
（2）以PCR为基础的分子标记：
RAPD；
AFLP；
SSR；
SSCP
（3）以DNA序列为核心的分子标记：
ITS；
SNP
22.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？
为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。
YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。
大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
23.如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你如何解释这种现象？
在实验过程中对照组不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，这种现象的可能原因是：
（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂DNA的污染
（2）细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落
（3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长
（4）一些实验误差，错将菌液放错
问答题
1.请论述植物基因工程在农业上的应用的研究进展前景▲
（1）抗病虫性：
目前,人们已发现并分离到了许多有用的抗虫基因,有的抗虫基因已导入植物体内而获得了转基因抗虫植物,有的转基因抗虫作物进入了大田试验,展现出了美好的应用前景,转抗虫基因的烟草、棉花在一些国家已进入商品化生产。
长期以来,植物病害的防治主要靠抗病育种和合理栽培管理。
采用有性杂交的方式来获得抗病品种存在着各种局限性,因为抗性基因是受多基因控制,并且往往与一些不良基因连锁在一起,而基因工程则是在单个目的基因上进行,具有快速性和定向性。
（2）提高品质：
基因工程育种的主要目标就是优质丰产育种。
目前改良作物产品质量的基因及应用主要有:
控制果实成熟的基因;
谷物种子贮藏蛋白基因;
控制脂肪合成基因;
提高作物产量基因等。
（3）提高花卉的观赏价值：
改变花色、花形、花期
（4）抗逆性：
根据植物抵抗逆境（如抗旱、抗热、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等）的生理反应,可以将自然界中多种适应性基因发掘出来,如将大豆的抗热性基因分离并转移到烟草中,并获得了成功。
2.根据所学的知识，论述农杆菌介导的基因转化和基因枪转化法两种方法的基本原理以及在农业生产上的应用。
原理
利用根瘤农杆菌Ti质粒（含T-DNA）介导将外源目的基因导入受体细胞的转基因方法称为农杆菌介导的基因转化。
基因枪法是一种全新的基因导入仪技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，气体基因枪以压缩气体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力，使气体基因枪枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室，因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。
应用
农杆菌介导技术在我国棉花育种上的应用进展。
山西农科院棉花所采用农杆菌介导技术，选育成功我国第一批通过审定的转基因抗虫棉GK95-
1。
中国农业科学院生物技术采用农杆菌介导技术，将Bt基因导入中棉所12号、泗棉3号等黄淮海棉区的主栽品种中,育成了高抗棉铃虫的转基因棉花新品种。
还采用农杆菌介导技术与花粉管通道技术将Bt抗虫基因与胰蛋白酶抑制基因（CPTI）重组成
“双价”抗虫基因,导入部分地区特早熟棉区的主栽品种中,
育成12个“双价”高抗棉铃虫的转基因棉花新品种,
这些育成品种的抗虫能力高达80
%以上。
基因枪转化法没有宿主范围的限制,靶受体类型广泛,是继农杆菌介导法之后应用最广泛的一项遗传转化技术。
目前,已有众多种植物采用基因枪转化技术获得了转基因植株,水稻、玉米、小麦等作物均获得成功,该技术示了旺盛的生命力和广泛的应用前景。
3.请详述PCR技术的原理、种类以及在生产实际中的应用情况。
原理：
是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
种类：
热启动PCR,Touch-down
PCR,RT-PCR,兼并引物PCR,巢氏PCR,反向PCR不对称PCR,原位PCR,连接酶链反应,RACE-PCR,AFLP,免疫-PCRMSP甲基化特异PCR
应用：
1、PCR在研究植作物生长发育方面的作用,
植物的生长、发育、分化和衰老都涉及许多基因的时空顺序表达，因此在这过程中基因表达的变化是揭示生长发育机理的重要手段。
2、PCR在作物抗病性基因分析、定位中的应用
在作物病害研究中，作物抗病性及其机制研究一直是当今作物病理学和作物抗病育种中的热点和焦点问题。
因此，寻找与作物抗病性紧密连锁的基因标记，即将抗病性基因进行定位的研究中具有十分重要的理论意义和实践意义。
3、PCR技术在食品科学中的应用
主要用于对食品中微生物含量的检测。
应用PCR技术，只需数小时，就可以用电泳法检测出来0.1mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列；
用PCR扩增细菌中保守的DNA片段，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。
4、PCR技术在医学中的应用
PCR技术主要用于肿瘤、遗传病和感染性疾病的诊断。
5、PCR在肿瘤诊断上的应用
目前用于肿瘤检测的PCR主要有定量RT-PCR，它在肿瘤诊断、治疗和微转移以及微小残留病灶检测等方面具有广泛的应用价值。
6、PCR在遗传病诊断上的应用
地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆性x综合症、苯丙酮尿怔等这些遗传病都可以通过PCR技术对患者基因进行扩增，然后利用基因分析直接检测出突变位点，
4.利用学过的知识设计一个植物基因转化的试验方案▲
1．农杆菌培养：
（1）挑单菌落接种到20mL添加相应抗生素的细菌液体培养基（pH7.0）中，27度，180rpm培养至OD600为0.6-0.8。
（2）取少量上述菌液，转入无抗生素的细菌液体培养基（pH7.0）中，27度,180rpm培养至OD600为0.2-0.5时即可用于转化。
2.无菌受体材料的准备：
取烟草幼苗的叶片，蒸馏水冲洗1次，70%乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6-8分钟，无菌水冲洗5次，吸干。
将无菌叶片剪成0.5cm×
0.5cm的小块，放在菌无小培养皿。
3.侵染：
将菌液倒入上述无菌小培养皿，几分钟后取出叶片，吸去附着的菌液。
共培养：
接种于共培养培养基上，25℃、黑暗培养2天。
选择培养：
转移到选择培养基上25℃光照（每天16小时光照，8小时黑暗）培养，每隔15天转移到新鲜的选择培养基上。
生根培养：
待烟草芽长到4-5片叶时，从愈伤组织上切下烟草芽，转移到生根培养基上，15天后转移到新鲜的生根培养基一次。
待根系发达后，小心取出带根系的烟草苗，尽量洗去粘附在根系上的培养基，移栽到土壤中．开始2-3天用保鲜膜保湿。
5.根据所学知识列出两个PCR使用过程中常发生的问题，并提出解决方案。
1、无扩增产物：
正对照有条带，而样品则无。
原因：
①模板:
含有抑制物，含量低；
②Buffer对样品不合适；
③引物设计不当或者发生降解；
④反应条件：
退火温度太高，延伸时间太短
。
解决：
①纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；
②更换Buffer或调整浓度；
③重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物；
④降低退火温度、延长延伸时间。
2、非特异性扩增：
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
①引物特异性差；
②模板或引物浓度过高；
③酶量过多；
④Mg2+浓度偏高
；
⑤退火温度偏低；
⑥循环次数过多。
①重新设计引物或者使用巢式PCR；
②适当降低模板或引物浓度；
③适当减少酶量；
④降低镁离子浓度；
⑤适当提高退火温度或使用二阶段温度法；
⑥减少循环次数
6.为了提高转化效率，实验中要考虑哪几个方面的因素（15分）。
（1）细胞生长状态和密度：
不要用经过多次转接或储于4度冰箱的培养菌。
最好多-70度或-20度甘油中保存的菌种中直接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
（2）质粒的质量和浓度：
用于转化的质粒DNA主要是超螺旋状态DNA（cccDNA）。
转化效率和外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。
一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
（3）试剂的质量：
所用的试剂，均需是最高纯度的（GR或AR），并用超水配制，最好分装于干燥的冷暗处。
（4）防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均需在无菌条件下进行，所用器皿如离心管最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
选择题（多选和单选）
1、第一个作为重组DNA载体的质粒是（C）
（a）pBR322（b）ColEl（c）pSCl01（d）pUCl8
2、Ⅱ型限制性内切核酸酶（BC）
（a）有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列
（b）仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
（c）限制性识别非甲基化的核苷酸序列
（d）有外切核酸酶和甲基化酶活性
（e）仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
3、在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子（AD）
（a）EDTA（b）柠檬酸钠（c）SDS（d）EGTA
4、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是（B）
（a）OCDNA>
SCDNA>
LDNA（b）SCDNA>
LDNA>
OCDNA
（c）LDNA>
OCDNA>
SCDNA（d）SCDNA>
LDNA
5、黏粒（cosmid）是一种人工建造的载体（ABC）
（a）它具有COS位点，因而可进行体外包装（b）它具有质粒DNA的复制特性
（c）进入受体细胞后，可引起裂解反应（d）进入受体细胞后，可引起溶源化反应
6、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为（C）
（a）染色体DNA断成了碎片（b）染色体DNA分子量大，而不能释放
（c）染色体变性后来不及复性（d）染色体未同蛋白质分开而沉淀
7、根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。
在下列文库中
（C）属cDNA文库
（a）YAC文库（b）MAC文库（c）扣减文库（d）BAC文库
8、关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确（C）
（a）具有可诱导性（b）具有可转移性
（c）细菌生长的任何时期都可以出现（d）不同细菌出现感受态的比例是不同的
9、在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是（A）
（a）诱导宿主的α肽的合成（b）诱导宿主的ω肽的合成
（c）作为酶的作用底物（d）作为显色反应的指示剂
10、基因工程发展史上理论上的三个重要发现是（ABC）
（a）DNA的发现（b）DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立
（c）遗传信息传递方式（中心法则）（d）限制性内切酶和DNA连接酶的发现
（e）载体的使用（f）基因的体外重组
11、在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?
（B）
（a）反应
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