微生物学实验基本技能培训教材.docx

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微生物学实验基本技能培训教材

第一部分微生物学实验基本技能培训

第一次实验（4学时，2人/组）

绪言

介绍本课程的教学大纲、实验指导书、实验要求和考核方法；

介绍本学期《微生物学实验》课程的容安排和时间安排。

介绍微生物实验室须知事项，注意生物安全、水电防火安全等。

介绍实验预习报告与实验报告的统一格式和要求。

实验预习报告：

标题

目的要求

原理

实验器材

操作步骤（含注意事项）

预期结果

实验报告：

标题

实验器材

实验程序与操作要点

结果

讨论与体会

思考题

考核：

评分比例：

平时考核占60%，期末考核占40%。

平时考核容包括预习报告、实验操作及实验报告（各占20%，40%，40%。

）

平时考核登记A+：

95，A：

90，B+：

85，B：

80，C+：

75，C：

70，D+：

65，D：

60，E：

≤50

实验一培养基的配制与无菌器材的准备（9月27日）

一、目的要求

1、明确培养基的配制原理。

2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

3、了解灭菌的常用方法及应用对象。

4、学习高压蒸汽灭菌锅的操作方法及注意事项。

5、学习干热灭菌的操作技术。

6、了解分离培养微生物前的有关准备工作。

二、基本原理

培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代产物的营养基质，它是进行科学研究，生产微生物制品及应用等方面的基础。

由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需要不同，选择配制不同的培养基。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。

待水蒸汽急剧地将锅的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。

一般培养基在121．3℃灭菌20分钟即可。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160—170℃），时间长（1—2小时）。

但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。

三、实验器材

1、试剂

牛肉膏、蛋白胨，氯化钠，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl等。

2、仪器和其他用具

试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，培养基分装器，天平，药勺，高压蒸汽灭菌锅，pH计，pH试纸等。

四、实验操作步骤

（一）、培养基的配制

称量-熔化-调pH-过滤-分装-加塞-包扎标记-灭菌-搁置斜面或倒平板-无菌检查

配方：

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH7.4-7.6。

固体培养基一般加琼脂15-20g。

1、牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备（以每组300ml计）

（1）称量：

除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。

蛋白胨极易吸水，称量时动作要快。

（2）熔化：

量取蒸馏水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。

加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。

（3）调pH：

待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/LNaOH边滴加边搅拌，使之达到pH7.4-7.6。

若偏碱，则用1mol/LHCl调节。

（4）过滤：

趁热过滤。

如无特殊要求，可省略。

（5）分装：

用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，每组分装6支试管。

余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。

在漏斗下口处套有一段透明胶管，胶管下部用弹簧夹夹紧。

分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。

分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。

（6）加塞：

试管加棉花塞（或泡沫塑料塞、试管帽），三角瓶加棉塞或泡沫塑料塞。

棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。

制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。

棉塞做成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。

棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。

棉塞的长度不小于管口直径的2倍，棉塞的2/3应在管或瓶，上端露出少许棉花便于拔取。

（7）包扎标记：

6支试管扎成一捆，棉塞外加一层牛皮纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用绳扎成活结。

三角瓶棉塞外加盖牛皮纸，用绳扎成活结。

用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。

（8）灭菌：

0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

见实验流程（三）。

（9）搁置斜面：

待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。

（10）倒平板：

待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。

备用。

（11）无菌检查：

灭菌培养基放入37℃培养箱中24-48小时，若无细菌污染则说明灭菌彻底。

2、牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备（600-800ml/班，由2组同学或教师完成）——老师代

按培养基配方比例依次准确地称取药品，除琼脂外，方法同固体培养基的制备过程。

各组需完成：

用分装装置将培养液分装到试管中，高度为试管长度的1/4。

每组6支试管，自行分装、包扎、灭菌。

（二）、准备无菌器材

1、培养皿：

洗净的培养皿烘干后，每组将10-12套培养皿叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，然后进行灭菌。

2、移液管：

洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。

塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。

每支吸管用一条宽约4~5cm的纸条，以30~50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。

每组1ml移液管5-6支、10ml移液管1支

3、试管和三角瓶：

试管和三角瓶都需要做合适的棉塞。

每组捆扎加塞试管4-5支，每组用三角烧瓶装入不超过三角瓶容积1/2的去离子水。

4、玻璃涂布棒：

1支用报纸包好。

上述物品用记号笔注明班级、组别、日期。

（三）、灭菌操作步骤

1、高压蒸汽灭菌

（1）关好排水阀门，放入蒸馏水至标度。

注意水量一定要加足，否则容易造成事故。

（2）将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。

旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度（不要太紧），然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。

（3）通电加温，打开排气阀门，排尽锅的空气。

全自动高压锅应关闭排气阀，

（4）恒温灭菌:

0.1MPa或15磅压力（锅温度相当于120℃～121℃）保持20～30分钟。

（5）降温：

自然降温，当锅蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，才能打开排气阀。

（6）取出灭菌物品：

如培养基需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上。

培养基、无菌水等：

湿热灭菌。

2、干热灭菌

（1）将包扎好的玻璃器皿摆入电热烘箱中，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。

（2）关紧箱门，打开排气孔，接上电源。

（3）待箱空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，加热至灭菌温度后，固定温度进行灭菌：

150～170℃灭菌1.5～2h。

2小时后切断电源。

（4）待烘箱温度自然降温冷却到60℃以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

放入烘箱加热灭菌：

150～170℃灭菌1.5～2h。

玻璃器皿：

可选择干热灭菌或湿热灭菌

五、注意事项

1、培养基的配制

加热熔化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其它固体物质粘在烧杯底上烧焦。

加热过程中所蒸发的水分应补足；pH值必须按不同培养基要求准确测定；所有器皿要清洁，忌用钢质、铁质器皿；分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端以免浸湿棉塞，引起杂菌污染；培养基灭菌的时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以达到灭菌效果且不损害必要营养成分；灭菌后的培养基须放37℃温箱培养24h，无菌生长时方可使用。

2、灭菌

使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故，如锅应加足水份，以防干烧；灭菌时，操作者切勿擅自离开；务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。

干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。

待烘箱温度自然降温冷却到60℃以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

六、思考题

1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？

如何检查培养基灭菌是否彻底？

2、高压蒸汽灭菌开始前，为什么要将锅冷空气排尽？

灭菌完毕后，为什么待压力降至0时才能打开排气阀，开盖取物？

七、讲授重点

1、培养基种类、配制培养基的基本原理与方法。

2、高压蒸汽灭菌和干热灭菌的原理和规操作流程。

八、实验要求

每组需完成制作棉塞、配制培养基、准备无菌器材

九、考核点

操作是否规、迅速

第二次实验（4学时，1人/组）

实验二微生物的分离、接种及环境微生物的检测（9月28日）

一、目的要求

1、体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。

2、证实环境中存在微生物。

3、掌握倒平板的方法。

4、学习微生物接种的基本技术。

5、学习分离微生物的常用方法。

二、基本原理

高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌的目的。

自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

平板分离法常用的有：

稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。

不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。

三、实验器材

1、菌种：

大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcusaureus）斜面培养物。

2、培养基

牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基。

3、仪器和其他用具

接种环、酒精灯、试管架、记号笔、培养皿、恒温培养箱等。

四、实验步骤

1、微生物接种技术

（1）试管斜面接种法（用接种环转接菌种）：

标记：

用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。

取菌：

左手拿大肠杆菌试管斜面培养物，右手持接种环，将接种环在火焰上进行灼烧灭菌，然后在火焰旁用右手小指指和无名指或右手掌缘拔出并夹住试管棉塞，试管口在火焰上烧一下。

接种环轻轻插入斜面上半部，在管壁冷却水上或管壁上使接种环冷后，挑起少许菌苔，再烧一下试管口，塞上棉塞，左手把斜面试管放回试管架。

右手持有菌接种环在酒精灯旁无菌区。

接种：

左手从试管架上取出标记好的斜面试管一支，右手掌缘拔出棉塞，试管口在酒精灯上灼烧一下，沾有菌苔的接种环迅速放进斜面底部，从下到上划一直线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。

完毕后，烧一下试管口，塞上棉塞，接种环在火焰上灼烧后放回原处。

培养：

试管放37℃培养