沙丁胺醇对大鼠树突状细胞功能的调节Word下载.docx

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结果：

倒置显微镜下，细胞形态学观察未发现实验组与对照组之间有明显差别；

流式细胞术分析表明：

沙丁胺醇上调大鼠DCs相对特异性标志OX62的表达，下调共刺激分子CD80，CD86和MHCⅡ类分子，但对髓系标志CD11c无明显影响；

丁氧胺可下调CD11c，MHCⅡ，CD80和CD86的表达，但对OX62的表达无明显影响；

沙丁胺醇与丁氧胺联合应用可明显下调CD80和CD86，MHCⅡ，CD11c的表达，上调OX62的表达；

混合淋巴细胞反应结果显示沙丁胺醇可以抑制DCs刺激T细胞增殖的能力；

丁氧胺也可抑制DCs刺激T细胞增殖的能力；

沙丁胺醇联合丁氧胺也可抑制DCs刺激T细胞增殖的能力，但丁氧胺既无明显阻断沙丁胺醇的效应，亦无显著的协同作用。

结论：

β2受体激动剂沙丁胺醇通过下调DCs表面MHCⅡ和共刺激分子表达，从而下调DCs功能，还能促使造血干细胞向DCs分化；

β2受体阻断剂丁氧胺对DCs免疫递呈功能的影响类似于β2受体激动剂沙丁胺醇的作用；

丁氧胺与沙丁胺醇共同应用未见明显阻断或叠加作用。

因此，沙丁胺醇和丁氧胺可能通过β2受体以外的途径调节DCs免疫功能。

【关键词】树突状细胞；

沙丁胺醇；

β2肾上腺素能受体；

免疫调节

　　［Abstract］Objective:

ToexplorethemechanismsofsalbutamolregulatingtheimmunefunctionofratbonemarrowderivedDCs.Methods：

SDratbonemarrowcellswereisolatedfromratfemurundertheasepsiscondition.TheimmaturationdendriticcellswereinducedfromhaemopoieticstemcellsbyrrGMCSF+rrIL4for8daysinvitro.ThematurationdendriticcellswerestimulatedbyLPSforanother2days.Salbutamol,butoxamine,andsalbutamol+butoxaminewereaddedintotheculturesystemofimmaturationdendriticcellsrespectively.ThemorphologyofDCswasdisplayedbyfluorescenceinversionmicroscope,andthecellsurfacemarkersondendriticcellsweredetectedbyflowcytometer.TheeffectofsalbutamolonDCsantigenpresentingcapacitywasevaluatedbyallogeneicmixedleukocytesreaction（MLR）betweenDCsandTcells.Results：

TherewerenosignificantdifferencewithinDC′smorphologyinanygroups.SalbutamolcouldupregulatetheexpressionofOX62,andreducedCD86,CD80andMHCclassⅡonDCssurface,buttherewerenoobviouseffectsonCD11c.TheexpressionofCD11c,CD86,CD80andMHCclassⅡwereobviouslydownregulatedbybutoxamine，exceptOX62weredownregulatedslightly.SalbutamolcombinedwithbutoxaminecoulddownregulatetheexpressionCD11c,CD86,CD80andMHCclassⅡonDCs,butcouldupregulatetheexpressionofOX62onDCs.BothsalbutamoltreatedDCsandbutoxaminetreatedDCscouldweakentheTcellsproliferationdramaticallyinMLR.Salbutamol+butoxaminetreatedDCscouldalsoinhibittheTcellsproliferationinMLR,buttherewerenoantagonismeffectsbetweensalbutamolandbutoxamine.Conclusion：

SalbutamolcoulddownregulatetheantigenpresentingfunctionofratbonemarrowderiveddendriticcellsviadecreasingtheexpressionofMHCclassⅡandcostimulatorymolecules,butcouldpromotethedifferentiationofRBMDCS.TheeffectofbutoxamineontheantigenpresentingfunctionofRBMDCSwassimilartosalbutamolandcouldn′treversetheeffectsofsalbutamol,sosalbutamolandbutoxaminecouldinhibittheantigenpresentingfunctionofDCsandnotviaβ2adrenergicreceptorpathway.

　　［Keywords］dendriticcells;

Salbutamol;

β2adrenergicreceptor;

immunoregulation

沙丁胺醇（Salbutamol）是1990年面世的一种新型β2肾上腺素能受体（β2adrenergicreceptor，β2AR）激动剂，化学名称为1（4羟基3羟甲基苯基）2（叔丁氨基）乙醇。

其对支气管平滑肌上的β2AR具有高度选择性，具有扩张支气管的作用，临床上广泛用于治疗哮喘［1］。

最近，许多研究者发现β2AR激动剂具有治疗自身免疫性疾病的作用，其机制可能是由于β2AR激动剂与免疫细胞上包括T细胞，B细胞，NK细胞，单核细胞表达的β2AR受体相互作用，通过活化腺苷酸环化酶，增加细胞内cAMP的水平，进而抑制Th1型细胞因子，相对上调Th2细胞因子的产生，从而抑制了Th1细胞漂移性疾病如自身免疫性疾病的发展，加重Th2细胞漂移性疾病如支气管哮喘的病情。

但是对于DCs的调节报道很少，而且其机制目前尚不清楚，因此本实验就沙丁胺醇对DCs的免疫功能的调节作了初步的研究。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1主要试剂

　　沙丁胺醇（β2AR激动剂）、丁氧胺（β2AR拮抗剂）和LPS为Sigma公司产品。

FITC和PE标记小鼠IgG1Isotype（BDBiosciences产品）；

FITC标记小鼠抗大鼠MHCⅡ，CD11c抗体，OX62抗体和PE标记山羊抗小鼠IgG（SeroTec公司产品）；

PE标记小鼠抗大鼠CD80和CD86抗体（Biolegend公司产品）；

重组大鼠GMCSF（rrGMCSF）和重组大鼠IL4（rrIL4）为RD公司产品；

RPMI1640和胎牛血清（Invitrogen公司产品）；

大鼠脾脏淋巴细胞分离液EZSepTM（达科为生物技术有限公司产品）；

3HTdR为中国原子能研究所产品。

　　1.1.2实验动物

　　6～8周龄、体质量180g左右雄性、SPF级Wistar和SD大鼠购于中科院上海动物研究所。

　　1.1.3主要仪器

　　β液体闪烁分析仪（贝克曼－库尔特公司）；

TE200荧光倒置显微镜（Nikon公司）；

Radiance2100共聚焦显微镜（BioRad公司）

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠树突状细胞的体外诱导

　　SD大鼠经乙醚麻醉后断颈处死，75%乙醇浸泡5min，无菌取股骨，剪去股骨两端，用1ml注射器抽取Hank′s洗液，将针头插入股骨一端的骨髓腔，反复冲洗骨髓腔，经200目铜网和4号针头过滤，使之分散成单个细胞。

然后经0.83%氯化铵裂解红细胞，洗涤2次，用PRMI1640完全培养基重悬，以每孔1×

106接种于24孔板中，按如下分组：

对照组rrGMCSF4ng/ml+rrIL44ng/ml；

处理组rrGMCSF4ng/ml+rrIL44ng/ml+沙丁胺醇250ng/ml、丁氧胺300ng/ml和沙丁胺醇250ng/ml+丁氧胺300ng/ml，隔天换半液一次，补充细胞因子和药物［2,3］，共诱导8天，最后在第9天加LPS4ng/ml刺激48h以诱导DC成熟。

　　1.2.2DCs表型鉴定

　　收集不同培养条件下DCs，细胞计数后分到1.5mlEP管中，保证每个样本的EP管细胞数为1×

105左右，在4℃下，采用荧光标记抗体分别作荧光染色，同时设未染色标本和PE或FITCIgG1Isotype对照，将染色后的细胞重悬于1mlPBS中洗涤1次，最后将细胞再重悬于1％多聚甲醛PBS中，采用BDFACScalibur进行表型分析。

　　1.2.3同种异体混合淋巴细胞反应

　　按上述方法处死Wistar大鼠，无菌取脾，用玻璃注射器针栓轻研脾，用400目尼龙网过滤，洗涤后用EZSepTM淋巴细胞分离液2000r/min30min分离脾细胞，Hank′s洗涤计数；

细胞重悬于RPMI1640完全培养基中，并将细胞浓度调整为2×

106/ml；

然后于96孔板中加入细胞，2×

105/孔，作为应答细胞。

刺激细胞采用经丝裂霉素25μg/ml处理30min的DCs；

按刺激细胞与反应细胞比例为1∶10加入96孔板，终体积为200μl。

设立未加DCs的脾细胞组和DCs加脾细胞的对照组；

沙丁胺醇250ng/ml、丁氧胺300ng/ml和沙丁胺醇250ng/ml+丁氧胺300ng/ml共3个处理组，每组6个复孔，细胞培养72h，于培养结束前12h掺入3HTdR0.5μci/孔，培养结束后，收集细胞于玻璃纤维纸上烘干，β液体闪烁分析仪测定CPM值。

　　1.2.4统计学分析

　　数据以±

s表示，对各组数据先进行单因素方差分析（onewayANOVA），然后采用SNKq检验，P0.05具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1形态学观察

显微镜下观察，骨髓造血干细胞在培养的前两天呈悬浮生长，并不贴壁，细胞形态以小而圆为主，无树枝样突起。

第5天细胞半贴壁生长，形成集落，可见少量毛刺，第7～8天细胞大量扩增，集落增多，细胞表面伸出树枝样突起，不规则，呈现典型的DCs形态。

各组在DCs的形态上未见明显差异（图1）。

　　2.2流式细胞术表型分析

对照组的表型表现为典型的DCs表型；

与对照组比较，沙丁胺醇250ng/ml实验组DCs细胞表面分子MHCⅡ，CD86和CD80分子的表达下调，CD11c无明显变化，但OX62的表达上调；

而其阻断剂丁氧胺300ng/ml实验组与对照组比较，表现为MHCⅡ，CD86和CD80，CD11c表达下调，OX62无明显变化；

与对照组比较，沙丁胺醇250ng/ml+丁氧胺300ng/ml实验组MHCⅡ，CD86和CD80，CD11c表达呈现下调趋势，但OX62的表达上调，结果重复两次（图2）。

2.3同种异体混合淋巴反应

无药物处理的DCs对照组与未加DCs的空白对照组比较，显示DCs能明显刺激T细胞的扩增（P0.05），沙丁胺醇250ng/ml、丁氧胺300ng/ml处理组DCs刺激T细胞增殖的能力明显弱于DCs对照组，沙丁胺醇250ng/ml+丁氧胺300ng/ml处理组DCs刺激T细胞增殖的能力也明显弱于对照组DCs（P0.05）。

丁氧胺未见有明显阻断沙丁胺醇的效应（图3）。

　　3讨论

DCs作为机体最重要的抗原提呈细胞（antigenpresentingcells，APC），它不仅可通过肽MHCII分子CD3复合物向CD4+细胞传递第一信号，还可以通过共刺激分子（尤其是CD80和CD86）与T细胞表面相应的配体结合，提供T细胞激活的协同刺激信号；

同时分泌细胞因子IL12和IL10等，启动初始T淋巴细胞活化，促使其增殖并极化，决定Th1或Th2应答类型［4,5］。

Th1/Th2细胞比例及功能的平衡是机体内环境稳定的重要调节因素，若出现失衡会导致自身免疫性疾病、肿瘤、超敏反应性疾病的发生、发展。

有研究表明，在肺内，若阻断CD80/CD86与配体CD28的作用，可抑制Th2类细胞因子的表达［6］，降低气道对变应原的敏感性，抑制I型超敏反应的发生。

所以通过药物阻断DCs向初始T细胞传递的双信号，必然会降低和减轻自身免疫性疾病、超敏反应性疾病的发生、发展。

抗原递呈细胞上存在各种儿茶酚胺受体，早在2000年Maestroni已经报道儿茶酚胺类药去甲肾上腺素（α受体肾上腺素能受体激动剂）可以上调C57BL/6小鼠骨髓来源未成熟DCs的免疫调节功能［7］，但选择性β2AR激动剂对DCs免疫功能的调节及其机制尚不清楚，我们就此进行了相关的初步研究。

我们通过文献检索发现沙丁胺醇具有干预DCs的作用［7-9］，因此选择沙丁胺醇作为β2AR激动剂研究其对DCs功能的调节作用及其机制。

实验结果提示：

沙丁胺醇250ng/ml实验组DCs表面标志MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达均较对照组减低。

为明确沙丁胺醇是否通过β2AR途径发挥作用，我们选用其阻断剂丁氧胺单独或和沙丁胺醇共同干预DCs的诱导，结果发现，丁氧胺实验组的DCs与沙丁胺醇实验组有相似的表现，沙丁胺醇+丁氧胺实验组同样也表现为下调MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达。

实验并未发现丁氧胺具有拮抗沙丁胺醇的作用；

考虑到MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达下降，会影响DCs抗原提呈能力，因此我们又利用同种异体混合淋巴反应来进一步验证。

结果发现，沙丁胺醇、丁氧胺和沙丁胺醇+丁氧胺处理组均能抑制DCs刺激T细胞增殖能力，也未见两者有明显的相互叠加和阻断作用。

因此我们推测沙丁胺醇抑制DCs并非通过β2AR依赖信号转导途径发挥作用，可能还涉及其他信号途径。

而丁氧胺由于与沙丁胺醇结构相似，因此也具有类似的生物学活性。

本实验为进一步研究该类药物的免疫调节功能提供了一个新的探索点，为免疫调节药物的研究提供了新的思路。

【参考文献】

　　［1］HaneyS,HancoxRJ.Overcomingbetaagonisttolerance:

highdosesalbutamolandipratropiumbromide,Tworandomisedcontrolledtrials［J］.RespirRes,2007,8

（1）:

19.

　　［2］RauerO,WohllebenG,SeubertS,etal.Analysisofmaturationstatesofratbonemarrowderiveddendriticcellsusinganimprovedculturetechnique［J］.HistochemCellBiol,2002,117（4）:

351-362.

　　［3］UthanaM,FairburnB,MirzaS,etal.Systematicevaluationoftheconditionsrequiredforthegenerationofimmatureratbonemarrowderiveddendriticcellsandtheirphenotypicandfunctionalcharacterization［J］.JImmunolMethods,2004,294（1/2）:

165-179.

　　［4］LiWM,LiuW,GaoC,etal.AntigenspecifictoleranceinducedbyIL10genemodifiedimmaturedendriticcellsinexperimentalautoimmunemyocarditisinrats［J］.ChinMedJ（Engl）,2006,119（19）:

1646-1652.

　　［5］TellanderAC,PetterssonU,RunstromA,etal.InterferencewithCD28,CD80,CD86orCD152incollageninducedarthritis.LimitedroleofIFNgammainantiB7mediatedsuppressionofdisease［J］.JAutoimmun,2001,17

（1）:

39-50.

　　［6］VermaelenKY,CarroMuinoI,LambrechtBN,etal.Specificmigratorydendriticcellsrapidlytransportantigenfromtheairwaystothethoraciclymphnodes［J］.JExpMed,2001,193

（1）:

512-560.

　　［7］MaestroniGJ.Dendriticcellmigrationcontrolledbyalpha1badrenergicreceptors［J］.JImmunol,2000,165（12）:

6743-6747.

　　［8］MachidaI,MatsuseH,KondoY,etal.Effectsofvariousantiasthmaticagentsonmiteallergenpulsedmurinebonemarrowderiveddendriticcells［J］.ClinExpAllergy,2005,35（7）:

884-888.

　　［9］MaestroniGJ,MazzolaP.Langerhanscellsbeta2adrenoceptors:

roleinmigration,cytokineproduction,Thprimingandcontacthypersensitivity［J］.JNeuroimmunol,2003,144（1-2）:

91-99.