最新大肠杆菌及菌落总数Word文档下载推荐.docx

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1.将内层锅去处,再向外层锅中加入适量的水,使水面与三角架相平为宜。

2.放回内层锅,并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品(注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果)。

3.加盖,并将盖上的排气管插入内层的排气槽内,再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。

4.本实验用0.1MPa,121.5℃,20min灭菌。

灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。

(2)大肠菌群的测定;

1)培养基:

①乳糖胆盐蛋白胨培养基:

蛋白胨20g,猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g,

0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH7.4。

制法:

将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装,每瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一个杜氏小管,l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基:

除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。

②伊红美蓝琼脂培养基:

蛋白胨10g,乳糖10g,K2HP042g,2%伊红水溶液20Ml,0.65%美蓝水溶液lOmL,琼脂17g,水1000mL,pH7.1。

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中,校正pH后分装.121℃灭菌15min备用。

临用时加入乳糖并熔化琼脂,冷至50-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。

③乳糖发酵管:

除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2)器材:

灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。

(四)实验方法

(1)水样的采集:

1)自来水:

先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2)池水、河水、湖水等地面水源水:

在距岸边5m处,取距水面10-15cm的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出。

如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存。

(2)细菌总数的测定:

1)水样稀释及培养:

①按无菌操作法,将水样作10倍系列稀释:

⑦根据对水样污染情况的估计,选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等,一般选择1、1:

10两种浓度;

水源水如河水等,比较清洁的可选择1:

10、1:

100、1:

1000三种稀释度;

污染水—被选择1:

1000、1:

10000三种稀释度),吸取1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后,将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±

1h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2)计算方法:

作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3)计数的报告:

①平板菌落数的选择:

选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。

如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。

若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择:

a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。

b.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定。

若其比值小于2,应报告其平均数;

若比值大于2,则报告其中较小的数字(l例2、例3)。

c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。

d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。

e.若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6)。

f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。

③细菌总数的报告:

细菌的菌落数在l00以内时,按其实有数报告;

大于100时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约。

为了缩短数字后面的0的个数,可用10的指数来表示,如表1“报告方式”一栏所示。

(3)大肠菌群的测定(多管发酵法):

表1稀释度的选择及细菌数报告方式

稀释度及菌落数

两稀释度之比

菌落总数/(cfu/g或cfu/mL)

报告方式(菌落总数)/(cfu/mL或cfu/g)

10-1

10-2

10-3

1

多不可计

164

20

-

16400

16000或1.6×

104

2

295

46

1.6

37750

38000或3.8×

3

271

60

2.2

27100

27000或2.7×

4

313

313000

310000或3.1×

105

5

27

11

270

270或

6

<10

7

305

12

30500

31000或3.1×

1)生活饮用水或食品生产用水的检验:

①初步发酵试验:

在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管),以无菌操作各加水样100mL。

在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管),以无菌操作各加入水样10mL。

如果饮用水的大肠菌群数变异不大,也可以接种3份100mL水样。

摇匀后,37℃培养24h。

②平板分离:

经24h培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶),分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上,37℃培养18—24h。

大肠菌群在EMB平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深;

挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检。

③复发酵试验:

将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个,37℃培养24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在。

④报告:

根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数,查表107-2(或表107-3),报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

2)水源水的检验:

用于检验的水样量,应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

①严重污染水:

1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。

②中度污染水:

10.1,0.1,0.01mL各1份。

③轻度污染水:

100,10,1,0.1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水:

10mLl0份。

表2大肠菌群检索表(饮用水)

备注

每升水样中大肠菌群数

<3

接种水样总量300mL(100mL2份,10mL10份)

8

18

13

38

14

24

52

30

70

22

36

92

43

120

31

51

161

9

230

10

40

69

>230

表3大肠菌群数变异不大的饮用水

阳性管数

接种水样总量300mL(3份100mL)

>18

表4大肠菌群检索表(严重污染水)

接种水样量/mL

0.1

0.01

0.001

<900

接种水样总量为1.111(1,0.1,0.01,0.001mL各一份)

+

900

950

1800

1900

2200

2300

2800

9200

9400

18000

23000

96000

238000

>238000

表5大肠菌群检索表(中度污染水)

<90

接种水样总量为11.11(10,1,0.1,0.01mL各一份)

90

95

180

190

220

280

920

940

9600

23800

>23800

表6大肠菌群检索表(轻度污染水)

100

<9

接种水样总量为111.1(100,10,1,0.1mL各一份)

9.5

19

23

28

94

960

2380

>2380

表7大肠菌群变异不大的水源水

160

接种水样总量100mL(10mL10份)

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。

同时应注意,接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管;

接种量在1mL以上者,应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。

然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数,查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7,报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

附:

滤膜法

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。

将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中,经过抽滤,细菌即被均匀地截留在膜上,然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。

再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落,计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。

(1)准备工作:

1)滤膜灭菌:

将3号滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中蒸煮灭菌3次,每次15min。

前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次,以除去残留溶剂。

2)滤器灭菌:

准备容量为500mL的滤器,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用121℃高压灭菌20min。

3)培养:

3)培养:

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。

(2)过滤水样:

1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上,轻轻地固定好滤器漏斗。

水样摇匀后,取333mL注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在—50kPa压力下进行抽滤。

2)水样滤完后再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴,两者间不得留有间隙或气泡。

若有气泡需用镊子轻轻压实,倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

(3)结果判定:

1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检。

①紫红色,具有金属光泽的菌落。

②深红色,不带或略带金属光泽的菌落。

③淡红色,中心颜色较深的菌落。

2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌,需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基,37℃培养6-8h,产气者,则判定为大肠菌群阳性。

3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3

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