毒死蜱降解菌的筛选鉴定doc.docx

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第4章毒死蜱降解菌的筛选鉴定

4.1毒死蜱简介

毒死蜱（chlorpyrifos），有效成分的化学名称为O,O-二乙基-O-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫逐磷酸酯，是美国陶氏化学公司（DowChemicalCo.）于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂，作为卫生杀虫剂，可以用来防治白蚁、虱子、跳蚤和蟑螂等多种卫生害虫[83]；作为农用杀虫剂,可有效防治水稻、苹果、蔬菜等上的蚜虫、螨类、小菜蛾等百余种害虫[84]。

值得注意的是，毒死蜱潜在危险性不容忽视，对鱼类及水生生物毒性较高[85]，对蚯蚓不安全，能够明显加重蚯蚓的死亡率[86]。

2000年6月8日美国环境保护局官员Browner指出,毒死蜱杀虫剂对人的神经系统和脑发育可能会有潜在影响，对儿童健康有害[87]。

许多国家对农产品，特别是蔬菜上的毒死蜱残留量进行了严格的规定。

在对外贸易中农药残留检测项目中也包括毒死蜱。

因此，毒死蜱的残留问题日益受到重视。

4.1.1高效降解菌株的筛选

4.1.1.1微生物的获取途径

目前，可降解农药的微生物的获得途径主要有：

从受农药污染严重的土壤中筛选分离具优良性状的菌种；定向培育优良菌种；在此基础上，进行诱变育种及构建工程菌。

从受农药污染严重的土壤中筛选分离具优良性状的菌种是目前采用最多的一种方法，一般是利用农药排污口及周围或长期使用某一种农药的土壤，经富集培养，分离出可降解农药的高效菌株。

定向培育优良菌种近年来也受到人们的关注，其方法就是在土壤中通过人为多次施药，培育可降解该农药的微生物，当再次施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤中的降解速度快于未施药土壤，则可确定可降解该种农药的微生物种群已被培育起来，而后从中分离出高效菌株。

这方面的研究已有过成功的例子，如Alian等通过向土壤施用萘丙酸草胺诱发该农药降解菌的产生并分离。

Ronald等连续向土壤施用乙烯菌核利，诱发筛选出该农药的降解菌假单孢杆菌。

在上述农药降解菌的培育过程中，诱变育种也是常用的方法。

王永杰等通过紫外诱变育种获得高效菌株，刘玉焕等用NTG诱变曲霉属乐果降解菌，用该菌处理乐果1小时后，乐果降解率由原来的56%提高到87%。

4.1.1.2微生物菌种的筛选步骤

在自然界，微生物是以混杂的形式群居于一起的，菌株筛选是以纯种培养为基础的，要根据菌种的特性、嗜好、形态上的差异，运用灵活的手段才能将所需要的微生物分离出来，一般的筛选步骤是：

采样、富集培养、纯种分离、筛选、鉴定。

（1）采样

为获取降解农药的微生物菌株，可从现已收藏的菌种中筛选，亦可以从土壤、水体或污染环境中采样经直接分离筛选或经富集培养获得。

土壤长期使用某一农药使得该农药降解菌逐渐富集，以后施入该农药时，其分解速率大大加快，这也是一些除草剂连续施用后效果下降的原因，如直接分离得不到目的微生物，可能是该微生物在试样中不存在或含量太少，遇到这种情况也可采用富集培养。

（2）富集培养

采来的样品中往往是我们想要的菌类含量不大，而另一些微生物却大量存在，为了容易分离到所需要的菌种，而让无关的微生物至少是数量上不要增加，可以选择性地配置培养基，选择一定的排样条件来控制，例如碳源的控制等。

农药降解菌的富集培养方法主要有：

液体培养法、土壤环流法、连续流动培养法。

通常是从长期被某种药剂污染的土壤和污水中取样经富集培养，再经固体培养分离纯化得到所需菌株。

根据Veldkamp的研究，富集培养可分为封闭式和开放式（即连续培养）两种类型。

恒化器作为连续培养是一种有效方法，以目标农药作为培养中的生长限制底物，在这种选择原则的作用下，可筛选到降解目标农药的微生物菌株或诱发出有降解能力的突变菌株。

由于农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，在世界各国的农业生产中被广泛生产使用，仅同时借助恒化器也可进行分子育种，如Kelloge曾在恒化器中接入各种有关农药降解的质粒菌，逐渐增加2，4，5-T的浓度进行诱导，结果培养出能降解除草剂2，4，5-T的工程菌，使难以被微生物降解的高残留除草剂有了“克星”。

可见富集培养对农药降解菌的分离筛选起着重要作用[35]。

（3）菌株的分离和筛选

农药降解微生物的分离、筛选是根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性，对营养物可利用性比较广泛的特性，在选择性培养基中加入某些特殊碳源为营养物质，使样品中少数能分解利用此类物质的微生物大量繁殖，并将其分离出来的方法。

纯种分离的方法一般采用混合平板分离法、平板划线分离法、涂抹法或稀释分离法。

要根据各类微生物生长所需要的营养和环境条件不同而人为地加以控制，有利于某种微生物在培养基上出现典型单个菌落。

4.2实验部分

4.2.1材料及仪器

4.2.1.1菌种来源

菌种来自巢湖某农药厂排污沟污泥，取回后用保鲜袋带回，并在4℃下保存。

4.2.1.2标准试剂与药品

二氯甲烷（Dichloromethane）：

分析纯AR汕头市西陇化工厂有限公司

硫酸（H2SO4）：

分析纯AR天津市博迪化工有限公司

氯化钠：

（NaCl）：

分析纯AR上海振企化学试剂有限公司

无水硫酸钠：

分析纯AR扬州沪宝化学试剂有限公司

毒死蜱（chlorpyrifos），又称乐斯本、氯吡硫磷，学名O,O-二乙基-O-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫逐磷酸酯。

原药为白色颗粒状结晶，室温下稳定，有硫醇臭味，相对密度1.398（43.5℃），熔点41.5～43.5℃，蒸气压为2.5×10-3帕（1.87×10-5毫米汞柱）（25℃），水中溶解度为2mg/L，易溶于异辛烷、甲醇等有机溶剂。

一般加工配制成乳油或颗粒剂。

为中等毒杀虫剂，具有触杀、胃毒和熏蒸作用。

原药纯度为96.5%。

4.2.1.3主要仪器

恒温振荡培养箱

气相色谱仪：

美国Agilent6890NGC，具电子捕获检测器（ECD）

恒温培养箱

CA-920-3超净工作台

岛津UV-2550分光光度计

高压灭菌锅

4.2.1.4培养基

（1）富集培养基（g/L）：

牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0，NaH2PO40.5，Na2HPO41.5，PH7.0，120℃高压灭菌20分钟；

（2）无机盐（MM）培养基（g/L）：

MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.002，K2HPO41.5，（NH4）2SO41.5，CaCl20.04，NaCl0.5，KH2PO40.5，PH7.2～7.4，120℃高压灭菌20分钟；

（3）富集及分离纯化培养基平板及斜面：

分别在富集培养基和无机盐培养基基础上加2％的琼脂，120℃高压灭菌20分钟；

（4）外加碳源的无机盐培养基（MMP）：

在无机盐（MM）培养基基础上加0.4g/L葡萄糖，115℃高压灭菌30分钟。

4.2.2步骤与方法

4.2.2.1菌株的筛选

（1）富集、分离与纯化

在100mL富集培养基中加入4g土样，添加毒死蜱浓度为50mg/L，在30℃，200r/min下振荡培养，7天后转接至新鲜培养基中，转接量10％，转接3次，毒死蜱浓度依次增加至100mg/L，150mg/L，200mg/L；按10％的接种量将富集培养液接入毒死蜱浓度为200mg/L的无机盐（MM）培养基中，驯化两个周期，每个周期7天；取稀释后的驯化培养液均匀涂布于富集培养基平板上，挑取生长旺盛的菌落在分离纯化培养基平板上连续划线分离，直至分离出单菌落，挑取单菌落测试降解效果。

（2）菌株筛选

1）活化：

挑取固体平板培养基上的单菌落，接种于50mL富集培养基中，30℃，200r/min振荡培养24小时。

2）接种：

按8％的接种量取富集培养液，10000r/min高速离心10分钟，弃去上清液，用无菌水洗涤后用PH7.2的磷酸盐缓冲溶液悬浮，接入外加碳源（葡萄糖0.4g/L）的无机盐培养基中，添加毒死蜱浓度为200mg/L。

30℃，200r/min振荡培养，每24小时取一次样，分别测生长量和降解率，同时做不接菌空白对照。

3）磷酸盐缓冲液配制方法：

取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液28mL和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液72mL，混合均匀即得100mLPH7.2的磷酸盐缓冲溶液。

（3）降解效能研究—毒死蜱浓度测定

1）样品前处理（萃取）

取8mL菌液，加入约1mL硫酸（体积比1：

1）酸化至PH值小于2，加入8mL二氯甲烷和约1克氯化钠，以破除乳化，充分摇匀，超声波萃取30分钟，在分液漏斗中振荡，静置，分层，收集下层有机相，上层水相用8mL二氯甲烷重复萃取一次，合并有机相，用加有无水硫酸钠的砂芯漏斗抽滤，定容至10mL，待分析。

2）气相色谱检测条件

火焰电离检测器（flameionizationdetector，FID）是利用氢火焰做电离源，使有机物电离，产生微电流而响应的检测器，又称氢火焰电离检测器。

它是众多的气相电离检测器之一，是破坏性的、典型的质量型检测器。

FID的突出优点是灵敏度高、线性范围宽对几乎所有的有机物均有响应，特别是对烃类，其响应与碳原子数成正比。

它性能可靠，结构简单，操作方便，死体积几乎为零，可与通常毛细管柱、快速GC和特快速GC毛细管柱直接相连。

因此，FID无论在过去的填充柱时期，还是毛细管柱已普及，正向全二维、快速气相色谱发展的今天，均得到普遍的应用。

1、进样：

7683自动进样器自动进样，进样口温度200℃，进样方式：

恒温不分流进样，进样量1μl；

2、柱箱：

HP-5石英毛细管柱（30m×0.32mmi.d.×0.25μm），柱箱温度采用程序升温，升温程序为：

初温100℃，保留2min，20℃/min升至180℃，保留2min，5℃/min升至200℃，保留5min；

3、检测器：

火焰电离检测器（FID），温度250℃；

4、载气：

氮气，流量1.5mL/min，尾吹20mL/min，空气流量400mL/min，氢气流量40mL/min。

3）农药标准曲线的制作

采用外标法的检量线法，即对样品中所含有的每一个组分都用标准样做一个浓度与面积（或峰高）的关系图，以后根据样品中某组分的峰面积在图上查得浓度。

具体做法是将毒死蜱标准样品用二氯甲烷梯度稀释至浓度分别为2g/L、1g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L，然后分别将各稀释标准样品用气相色谱分析仪测定，每个标样连续进样三次，取峰面积的平均值对标样的浓度作标准曲线。

4）降解率计算公式

降解率（%）=（对照样品残留量—处理样品残留量）/对照样品残留量×100

4.2.2.2菌株生长情况

（1）生长量测定

以相应的培养基做对照，菌液稀释两倍后用紫外分光光度计于600nm处测吸光度。

（2）生长曲线测定

挑取菌种在富集活化培养基中活化24小时，按8％接种量接入富集培养基中，30℃，200r/min振荡培养，24小时内每2小时取一次样，后每4小时取样测OD600值。

4.2.2.3生长条件优化

（1）pH对菌株生长的影响

调节外加碳源的无机盐培养基（50mL）PH值分别为4，5，6，7，8，9，按8％接种量接入活化后重悬的菌液，添加毒死蜱浓度为200mg/L，30℃，200r/min培养，72小时后测生长量。

（2）底物浓度对菌株生长的影响

在无机盐培养基中按8％接种量接入活化菌液，添加毒死蜱浓度分别为50，100，200，300，400mg/L，同时做一不接菌对照，30℃，200r/min培养，72小时后测生长量。

（3）菌株生长随时间变化规律

在无机盐培养基中按8％接种量接入活化菌液，添加毒死蜱浓度为200mg/L，于30℃，200r/min下培养，分别于0，24，48，72，96，120，144小时后测生长量。

（4）最佳（唯一）碳氮源实验

培养基（g/L）：

MgSO4·7H2O0.2,NaH2PO40.5,CaCl20.1,K2HPO40.5

碳源：

葡萄糖，蔗糖，