微生物限度验证.ppt

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微生物限度检验方法验证主讲：

柴海毅为什么验证？

与国际通用要求接轨促进微生物检验定量化推进微生物检验标准化提升药品质量的要求中国药典2010年版二部：

“凡例”-检验方法和限度二十三、本药典正文收载的所有品种，均应按规定的方法进行检验；如采用其他方法，应将该方法与规定的方法做比较试验，根据试验结果掌握使用，但在仲裁时仍以本药典规定的方法为准。

美国FDA分析方法验证指南：

“分析方法验证”分析方法验证是论证某一分析方法适用于其用途的过程，分析方法的验证过程是从申请者有计划地系统性收集验证资料以支持分析方法开始的。

验证目的-在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检出。

-充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。

验证目的确认一种检验方法。

验证实验检验条件检验方法检验规程样品量稀释液种类稀释液体积中和剂培养基培养时间培养温度SOP影响微生物检验的因素微生物检验的检出率很低下样品/药品自身的特殊性样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂培养基的特性培养条件人员因素实验器材的选择恢复试验微生物方法验证的实质就是评价和考察微生物恢复试验（恢复生长）的可信度。

恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物都能够恢复生长。

验证内容

（一）计数方法验证

（二）控制菌检验方法验证微生物限度检验方法验证

（一）计数方法验证供试液制备中国药典2010年版表面活性剂、中和剂或灭活剂：

应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。

供试液的体积：

100ml。

稀释剂中国药典2010年版1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液固体：

10g供试品+稀释剂至100ml液体：

10ml供试品+稀释剂至100ml微生物计数方法验证菌种选择原则普遍性-G+、G-、-杆菌（长、短杆菌）-球菌-真菌（丝状真菌、酵母菌）特殊性-从环境中分离出来的常见杂菌-从样品中分离出来的常见杂菌微生物计数方法验证用菌株：

中国药典2010年版菌株名称CMCC编号培养条件大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）CMCC（B）44102金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC（B）26003营养肉汤培养基30-3518-24h枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CMCC（B）63501白色年珠菌（Candidaalbicans）CMCC（F）98001改良马丁培养基20-2524-48h黑曲霉菌（Aspergillusniger）CMCC（F）98003改良马丁斜面培养基20-255-7天微生物计数方法验证用菌株：

USP24版菌株名称ATCC编号培养条件大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）ATCC873932+2.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC653832+2.5铜绿假单胞菌（Staphylococcusaureus）ATCC902732+2.5生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）ATCC1143732+2.5枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）ATCC663322+2.5白色年珠菌（Candidaalbicans）ATCC1023122+2.5黑曲霉菌（Candidaalbicans）ATCC1640422+2.5计数方法验证步骤选定一个方法确定检测限设计验证方案样品的选择：

合格的样品

（1）按照正常取样方法取样的样品

（2）符合限度标准的样品检测限：

样品中细菌被检出的最低量。

细菌100cfu/ml霉菌+酵母菌100cfu/ml细菌50cfu/ml霉菌+酵母菌50cfu/ml平板法：

薄膜过滤法：

检测限设定依据：

微生物计数原则限度/标准数理统计方法学的要求恢复试验恢复生长是指人为地添加的测试菌（污染菌）在供试液中的生长水平回收率则是测试菌（污染菌）在样品供试液中的存活率与测试菌污染菌的检出率的比值恢复试验的原则消除样品的抑菌性样品的处理方法和检验方法不应影响样品中微生物的生长如何消抑菌活性稀释法中和法离心法薄膜过滤法组合运用中国药典2010年版表l常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢钠酚类、乙醇、吸附物稀释法醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯汞类制剂亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化合物卵磷脂碘酒、洗必泰类聚山梨酯卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA）镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素-内酰胺酶USP列举出的部分抑菌剂/中和剂抑菌抑菌剂中和中和剂戊二醛硫酸氢盐酚类、乙醇、山梨酸酯稀释剂醛类稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、吐温汞类制剂硫酸氢盐、硫乙醇酸盐、硫代硫酸盐二重双胍卵磷脂碘酒、洗必泰类吐温卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸Mg+2或Ca+2磺胺类对氨基苯甲酸样品本底含菌量高，怎么处理？

样品本底含菌量高：

1、稀释：

供试液梯度稀释2、过滤：

0.45m滤膜过滤测试菌悬液的要求:

中国药典2010年版：

1、室温下放置，2小时内使用；2、保存在28，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可以保存在28，在验证的贮存期内使用。

计数方法验证（平板法）样品组：

样品溶液（1/10）9.9ml104cfu/ml菌悬液0.1ml稀释剂对照组：

蛋白胨稀释液9.9ml（阴性对照）104cfu/ml菌悬液0.1ml菌种组：

104102（阳性对照）空白样品组：

计数A计数B计数C计数D结果判断依据：

1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：

-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。

2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：

-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。

-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。

3、空白样品组测试结果阴性，表明：

-本次测试样品合格。

-无菌操作正确。

没有污染事件发生。

可以接受的标准平板法1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三名不同的微生物检验人员2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：

无污染事件发生-样品组（回收率）：

A=C30%（偏差30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符计数方法的验证-各国药典结果判断标准USP：

各试验菌的回收率均不低于70%。

EP、BP、JP:

各试验菌的回收率均不低于80%。

中国药典：

各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%。

不可以接受的标准

（1）：

1、阴性对照：

阴性对照（包括蛋白胨组和空白样品组）发生污染事件。

菌落鉴别：

-污染菌是测试菌：

检验员无菌操作培训。

-污染菌不是测试菌：

偏差调查。

2、阳性对照：

样品组的试验数据与检测限不符。

（微生物的回收率过高或过低）结论：

样品组的试验结果无效。

重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。

不可以接受的标准

（2）：

3、样品组：

-三人三次的试验结果应该与检测限相符。

-第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的试验证实。

-任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程有缺陷，验证需重新进行。

优化更新步骤：

消除抑菌活性。

稀释样品时，应确认检测限（检验限度）低于或等于标准。

不同的细菌，一个好的结果可以从不同的稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于日常的监测中。

平板法优化更新方法：

平板法优化更新方法：

稀释样品：

1/101/501/100增加培养基量延长培养时间添加抗活性剂计数方法验证（薄膜过滤法）样品组：

样品溶液（1/10）10ml过滤5x102cfu/ml菌悬液0.1ml蛋白胨对照组：

蛋白胨稀释液10ml过滤（阴性对照）5x102cfu/ml菌悬液0.1ml菌种组：

5x102cfu/ml菌悬液0.1ml过滤（阳性对照）过滤空白样品组：

计数A计数B计数C计数D可以接受的标准薄膜过滤法1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三名不同的微生物检验人员2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：

没有污染事件发生。

-样品组：

A=C30%（偏差30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符薄膜过滤法优化更新方法：

增加冲洗量增大样品稀释倍数（1/50，1/100）延长培养时间添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以）2010年版中国药典（附录109页）：

若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。

然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。

因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。

若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

2010年版中国药典（附录109页）：

计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。

微生物检验方法验证

（二）控制菌检验方法验证控制菌检验方法验证菌种选择原则样品的给药途径和类型决定了采用何种控制菌检查验证。

增菌培养基的确定增菌培养基的实际用量等同控制菌检查方法验证时的用量。

验证的开始。

控制菌检验方法验证选定一个方法：

CP或USP设定检测限：

不得检出设计验证方案控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）增菌（计数）样品组样品组蛋白胨蛋白胨对照对照菌悬液菌悬液对照对照样品样品100ml增菌液增菌液大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102cfu/ml大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102cfu/ml蛋白胨蛋白胨100ml增菌液增菌液大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102cfu/ml培培养养样品组样品组空白样空白样品对照品对照控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）确认培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检，必要时要鉴别。

4组组测试样品测试样品观察CP法USP法18小时24小时结果判断依据：

1、样品组和蛋白胨对照组测试结果一致，表明：

-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。

2、蛋白胨对照组和菌种组测试结果一致，表明：

-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。

-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。

3、空白样品组测试结果阴性，表明：

-本次测试样品合格。

-无菌操作正确。

没有污染事件发生。

可以接受的标准1、样品检验-增菌液经培养后明显浑浊-分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落2、阳性对照-增菌液经培养后必须是浑浊的-分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落3、阳性菌计数-菌悬液的计数结果应该25cfu/ml不可以接受的标准（无效试验）1、样品检验-与可接受的标准不符结论：

重新设计试验步骤2、阳性对照-与可接受的标准不符结论：

重新试验3、阳性菌计数-与标准不符结论：

重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作新的菌悬液直到符合规定。

优化控制菌验证步骤：

扩大增菌液的体积100ml200ml300ml400ml500ml延长增菌液的培养时间采用薄膜过滤法加入活性试剂控制菌检验方法验证（薄膜过滤法）（以大肠杆菌为例）加10ml稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。

加100ml样品增菌液到薄膜过滤器中。

加0.1ml、5X102cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该有50cfu个菌落出现。

失败的验证（无效试验）1、样品中有些成分是固有的抑菌成分2、参考防腐剂的实验/验证数据3、参考样品中各成分的理化性质验证结果根据验证