人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程Word文档格式.docx

人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程Word文档格式.docx

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温度显示：

经计算机计算的实际样品温度，精确到0.1℃

加热冷却速度：

平均温度变化速度1℃/秒

温度准确性：

正负0.25℃，35－100℃范围

升降温重现性：

任意温度达到时间误差小于5秒

3操作说明

3.1实验程序运行：

3.1.1首先打开电脑，进入操作系统后，打开7500仪器电源；

3.1.2双击桌面上的7500快捷方式

，进入以下界面：

3.1.3点击

，进入以下操作界面，按照默认设置，直接点击“完成”（Finish）：

3.1.4在96孔板中选择所放置样本对应的区域，如下图：

3.1.5点击

按钮，在弹出的对话框中选择FAM-TAMRA荧光-淬灭基团，点击“AddToPlateDocument”：

3.1.6点击

按钮，如图所示，在弹出的对话框中勾选FAM荧光

，内参荧光选择

，点击“Close”：

3.1.7在

选项下，逐个双击所选样本，设置样本类型

和标准点定量值

：

3.1.8点击

选项，按照试剂盒说明书设置相应的扩增程序：

3.1.9点击

按钮，为使用结果文件设定保存路径和名称。

3.1.10点击“Start”开始运行扩增程序。

3.2实验结果分析：

3.2.1点击

按钮，打开使用结果文件；

3.2.2点击

选项，进入结果分析操作界面。

点击下面的

选项，双击纵坐标，选择Linear项，调整为线性坐标，点击“OK”确定：

3.2.3选取所有样本，手动设定阈值为最大荧光值的5%左右为宜。

（设定原则：

改过所有阴性，使标准曲线相关系数尽可能接近1）。

，点击“Analyze”进行定量分析。

3.2.4点击

选项，看相关系数是否>

0.98，线性是否良好。

3.2.5点击选项，查看样本的定量值，如需查看样本的Ct值，点击Analysis菜单，选择Display→Ct

3.2.6点击

选项，可以报表方式查看实验结果，如下图：

4维护保养

4.1仪器每次使用完毕均需做好清洁工作；

若加热模块内有脏污，可先用肥皂水擦洗，然后用双蒸水擦洗，最后设定仪器90℃、5分钟，使内水份蒸发干即可；

4.2仪器不使用时盖子要盖好，以免灰尘落进仪器内；

4.3透镜的清洁：

在反应舱上壁有一个透镜，仪器使用过程中透镜上有可能沾上灰尘、水份，影响实验结果，可用洒精棉球擦拭透镜；

4.4卤素灯的更换：

灯泡使用超过2000小时后，当测试波长下的荧光强度减弱，曲线呈锯齿状进而影响检测结果的可靠性时，必须更换卤素灯。

可由技术主管或厂家工程师更换，更换方法见仪器‘UserGuide8-25至8-27’。

更换后应请厂方对仪器作一次校正。

5校准

每年常规由厂方对该仪器作一次校准。

调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。

不得由一般实验人员进行该项操作。

校正后，要进行一次质控、空白试剂的实验，并对实验结果进行评价，并做好记录。

5.1执行目标区（ROI）校正

5.1.1在ROIInspector（ROI检查器）对话框中：

a.在ExposureTime（曝光时间）字段中，输入2048。

b.选择FilterA（滤光器A）。

5.1.2单击瞬像：

软件中用反应孔中的红色表示图像饱和。

5.1.3单击生成校正

5.1.4SDS成功生成校正图像，验证以下各项：

报告的像素密度不超过750；

报告的发现反应孔数为96；

在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。

5.1.5单击保存校正

5.1.6为剩余的滤光器重复步骤1-5。

5.1.7从7500扩增仪上取下ROI校正反应板，单击done关闭ROIInspector。

5.1.8在SDS软件中选择file→close。

当提示保存反应板文件时，单击NO。

5.2执行背景校正

5.2.1准备背景反应板

5.2.2创建背景校正反应板文件：

file→new→newdocumentwizard→file→save

5.2.3运行背景反应板：

按压托盘以打开它，将背景反应板装入反应板架，关闭托盘，在SDS软件中单击Instrument→start。

5.2.4分析背景数据：

程序运行完毕单击OK，取出背景反应板放入其包装冷冻柜储存。

单击analysis→ExtractBackground→OK。

在反应板文件中选择result→spectra，选择反应板文件的所有反应孔，查看原始数据中是否有超过72,000，荧光标准单位（FSU）的异常光谱峰值。

5.2.5选择file→close

5.3执行纯荧光校正

5.3.1准备纯荧光校正反应板

5.3.2创建纯荧光校正反应板文件：

file→new→newdocumentwizard→finish

5.3.3运行纯荧光校正反应板：

在PureSpectraCalibrationManager（纯荧光校正管理器）中：

a.在DyeList（荧光列表）字段中，选择一种要校正的纯荧光。

b.单击校正c.当提示您断开反应板文件连接时，单击（是）。

5.3.4将纯荧光反应板装入反应板架，在提示您装入反应板文件的对话框中，单击（是）并等待程序运行并完成（约需8分钟）。

在SDS软件执行纯荧光校正期间，将会锁定PureSpectraCalibrationManager（纯荧光校正管理器）窗口中的各种控制。

5.3.5程序完成取出反应板，单击下一荧光，重复1-5步骤执行CY-3、CY-5和TEXASRED纯荧光的校正程序。

5.3.6所有荧光校正结束后，单击finish。

5.3.7提取纯荧光数据：

在反应板文件中选择result→spectra，选择反应板文件的所有反应孔，analysis→ExtractPureSpectra→OK

5.3.8使用下表作参考，验证在正确的滤光器上出现纯荧光的光谱峰值。

5.3.9选择file→close，SDS软件显示下一个纯荧光反应板的反应板文件，重复5.3.7-5.3.9步骤以提取剩余纯荧光的校正数据。

5.3.10当完成剩余荧光的纯荧光校正程序后，关闭剩余的反应板文件。

6相关表格

扩增仪保养维护记录表，编号PCR（N）-SOP-201-01。

批准记录

批准人

批准时间

有效期

□1年；

□其他：