人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程Word文档格式.docx

1、温度显示：经计算机计算的实际样品温度，精确到0.1加热冷却速度：平均温度变化速度1/秒 温度准确性：正负0.25，35100范围 升降温重现性：任意温度达到时间误差小于5秒3 操作说明3.1 实验程序运行：3.1.1 首先打开电脑，进入操作系统后，打开7500仪器电源；3.1.2 双击桌面上的7500快捷方式，进入以下界面：3.1.3 点击，进入以下操作界面，按照默认设置，直接点击“完成”（Finish）：3.1.4 在96孔板中选择所放置样本对应的区域，如下图：3.1.5 点击按钮，在弹出的对话框中选择FAM-TAMRA荧光-淬灭基团，点击“Add To Plate Document”：3.

2、1.6 点击按钮，如图所示，在弹出的对话框中勾选FAM荧光，内参荧光选择，点击“Close”：3.1.7 在选项下，逐个双击所选样本，设置样本类型和标准点定量值：3.1.8 点击选项，按照试剂盒说明书设置相应的扩增程序：3.1.9 点击按钮，为使用结果文件设定保存路径和名称。3.1.10 点击“Start”开始运行扩增程序。3.2 实验结果分析：3.2.1 点击按钮，打开使用结果文件；3.2.2 点击选项，进入结果分析操作界面。点击下面的选项，双击纵坐标，选择Linear项，调整为线性坐标，点击“OK”确定：3.2.3 选取所有样本，手动设定阈值为最大荧光值的5%左右为宜。（设定原则：改过所有

3、阴性，使标准曲线相关系数尽可能接近1）。，点击“Analyze”进行定量分析。3.2.4 点击选项，看相关系数是否0.98，线性是否良好。3.2.5 点击选项，查看样本的定量值，如需查看样本的Ct值，点击Analysis菜单，选择DisplayCt3.2.6 点击选项，可以报表方式查看实验结果，如下图：4 维护保养4.1 仪器每次使用完毕均需做好清洁工作；若加热模块内有脏污，可先用肥皂水擦洗，然后用双蒸水擦洗，最后设定仪器90、5分钟，使内水份蒸发干即可；4.2 仪器不使用时盖子要盖好，以免灰尘落进仪器内；4.3 透镜的清洁：在反应舱上壁有一个透镜，仪器使用过程中透镜上有可能沾上灰尘、水份，影

4、响实验结果，可用洒精棉球擦拭透镜；4.4 卤素灯的更换：灯泡使用超过2000小时后，当测试波长下的荧光强度减弱，曲线呈锯齿状进而影响检测结果的可靠性时，必须更换卤素灯。可由技术主管或厂家工程师更换，更换方法见仪器User Guide 8-25至8-27。更换后应请厂方对仪器作一次校正。5 校准每年常规由厂方对该仪器作一次校准。调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。校正后，要进行一次质控、空白试剂的实验，并对实验结果进行评价，并做好记录。5.1 执行目标区（ROI）校正5.1.1 在 ROI Inspector（ROI 检查器）对话框中：

5、a. 在 Exposure Time （曝光时间）字段中，输入 2048。b. 选择 Filter A（滤光器 A）。5.1.2 单击瞬像：软件中用反应孔中的红色表示图像饱和。5.1.3 单击生成校正5.1.4 SDS成功生成校正图像，验证以下各项：报告的像素密度不超过750；报告的发现反应孔数为96；在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。5.1.5 单击保存校正5.1.6 为剩余的滤光器重复步骤1-5。5.1.7 从7500扩增仪上取下ROI校正反应板，单击done关闭ROI Inspector。5.1.8 在SDS软件中选择fileclose。当提示保存反应板文件时，单击NO。5.

6、2 执行背景校正5.2.1 准备背景反应板5.2.2 创建背景校正反应板文件：file new new document wizard file save5.2.3 运行背景反应板：按压托盘以打开它，将背景反应板装入反应板架，关闭托盘，在SDS软件中单击Instrument start。5.2.4 分析背景数据：程序运行完毕单击OK，取出背景反应板放入其包装冷冻柜储存。单击analysis Extract Background OK。在反应板文件中选择result spectra，选择反应板文件的所有反应孔，查看原始数据中是否有超过 72,000， 荧光标准单位 （FSU） 的异常光谱峰值。5

7、.2.5 选择file close5.3 执行纯荧光校正5.3.1 准备纯荧光校正反应板5.3.2 创建纯荧光校正反应板文件：file new new document wizard finish5.3.3 运行纯荧光校正反应板：在 Pure Spectra Calibration Manager（纯荧光校正管理器）中：a. 在 Dye List （荧光列表）字段中，选择一种要校正的纯荧光。b. 单击校正c. 当提示您断开反应板文件连接时，单击（是）。5.3.4 将纯荧光反应板装入反应板架，在提示您装入反应板文件的对话框中，单击（是）并等待程序运行并完成（约需 8 分钟）。在 SDS 软件执行

8、纯荧光校正期间，将会锁定 Pure Spectra Calibration Manager（纯荧光校正管理器）窗口中的各种控制。5.3.5 程序完成取出反应板，单击下一荧光，重复1-5步骤执行CY-3、CY-5 和 TEXAS RED 纯荧光的校正程序。5.3.6 所有荧光校正结束后，单击finish。5.3.7 提取纯荧光数据：在反应板文件中选择result spectra，选择反应板文件的所有反应孔，analysis Extract Pure Spectra OK5.3.8 使用下表作参考，验证在正确的滤光器上出现纯荧光的光谱峰值。5.3.9 选择file close，SDS 软件显示下一个纯荧光反应板的反应板文件，重复5.3.7-5.3.9步骤以提取剩余纯荧光的校正数据。5.3.10 当完成剩余荧光的纯荧光校正程序后，关闭剩余的反应板文件。6 相关表格扩增仪保养维护记录表，编号PCR（N）-SOP-201-01。批准记录批准人批准时间有效期1年；其他：