细胞因子检测Word文件下载.docx
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6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变得底物结晶被溶解。
7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为6３0nm分别测量OD值、测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。
ＯD５7０ｎｍ-ＯＤ63０ｎm,再减去培养液对照得OD值。
8、用IＬ－１标准品各稀释度IL－１含量（Ｘ）与各稀释度对应得OＤ值（Y）作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品ＩL—2得活性单位（u/mｌ）、
（三）注意事项
1、IＬ-1诱生剂得浓度,培养条件与细胞浓度对结果均有明显影响,应进行预试验以确定最佳实验条件、
2、培养器皿与研磨条件:
２4孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。
玻璃瓶培养有时会因玻璃质量与清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。
大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中得污染、研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。
二、TNF得检测（免疫学测定法,双抗体ＥLＩSA夹心法）
（一）原理选用两种针对rHuTＮF—α分子不同表位得单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF—α,则形成抗体－TＮF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中ＴNF-α得含量。
（二）材料与试剂
１、包被抗体:
使用时用包被缓冲液作适当稀释。
2、酶标抗体:
使用时用稀释液作适当稀释、
3、标准品:
ｒHｕTNＦ-α（10ng／mｌ）,使用时用稀释液作倍比稀释、
4、阴性对照液（未免疫鼠Ｉg）。
5、ＡBＴＳ底物:
2,２'
—Azino－bis-（３—ehtylbｅｎzthioｚoliｎe 6-sulfonｉｃacid）,２,2'
-连氮基—双（3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸）。
6、9６孔ＥLISA板。
７、0.１5mｏl/L,pH7、４PBＳ:
配其它液体用、
８、包被缓冲液:
0、０5mol/Ｌ,pH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
9、洗涤液:
0。
0５％Ｔwｅeｎ 20－PＢS、
10、稀释液:
4％PＥG-洗涤液（用于稀释标准品与酶标抗体）。
１1、底物缓冲液:
０.1mol/L,pH5、０柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
1２、3％H２O2。
13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释。
１４、ELＩSA读数仪等。
（三）操作步骤
1、包被将稀释好得包被抗体加入ＥLISA板,100μｌ/孔,４%放置24h或48ｈ。
２、加待检标本洗涤液冲洗ELIＳA板３次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释得标准品,100μl／孔,37％,１h、标准品稀释方法:
取标准品150μl（10ng/ｍl）倍比稀释7个浓度:
5ng/mｌ、2、５ng/mｌ、１。
2５nｇ/ml、６25pg/ml、3１2pg/mｌ、15６ｐg／ml与７８pg/ml。
３、加酶标抗体:
洗板3次,加入稀释好得酶标抗体,100μl/孔,37℃,1ｈ。
4、显色:
洗板3次,加入配好得ＡBTS显色液,１00μｌ/孔,室温或37℃显色15～３０mｉｎ。
５、ELIＳA读数仪测41０nm处OD值,绘制标准曲线。
6、从标准曲线查得待测样品中得TNF－α含量、
四、注意事项
1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多得血清。
2、标本在2～8℃可储存３天,超过3天应放入—20℃或-70℃,避免反复冻融、
３、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。
4、叠氮钠（NaN3）对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用,在本实验系统中应避免使用、
5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2～８℃,保存６个月以内。
附:
试剂配制
１.0.15moｌ/L,pH7、4 PＢS
KＨ2PＯ４0。
2g
Na２HＰO４·
12H２Ｏ2.9ｇ
ＮaCｌ8、０g
KＣl 0。
双蒸水加至100ｍl
2. 包被缓冲液
Na2CO３1、59g
NａHCO32.93g
双蒸水加至1000mｌ
3.洗涤液
PBS1000ｍl
Tｗeeｎ2００.5ml
4。
稀释液
洗涤液100ｍl
鸡蛋清 0。
6mｌ
PEG（聚乙二醇,MW６0０0）2。
0g
NaＣl2。
9g
5。
底物缓冲液
Nａ2ＨPO4·
1２H２O1、79ｇ
拧檬酸１.29ｇ
双蒸水加至１00ml
６。
ABS显色液
ABTS5mｇ
底物缓冲液10mｌ
3%H2O220μl
三、IL-２得检测（基因得检测）
细胞因子基因得检测包括对其DNA得检测与mRNA表达得检测,常用得方法有Soｕｔhｅrn印迹,斑点印迹,PCＲ,原位杂交及原位PCR等,Ｎorthern印迹及RT－PCR。
本文介绍ＩL-2mRNA得测定（斑点杂交法）、将ＲNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。
本法可用于基因组中特定基因及其表达产物得定性及半定量分析、由于其操作比Noｒｔhern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品得检测,故很适合于临床应用。
亦可用于ＤNA得检测。
但其缺点就是不能鉴定所测基因得分子量。
（一）主要试剂
1.RＮA提取试剂:
TRIZOL试剂（Gｉbcoｌ,No、15596—026）,DEPC水（Fluｋa,Nｏ。
9８021０）
质粒提取试剂盒:
（Promegａ:
WizardMiniprepｓＤNＡ,Ｎｏ、11７）
3。
DＮA片段提取试剂盒:
（La Jｏｌla）
4、地高辛标记与检测试剂盒:
（ＢoｅｒhｉngerMannheim,No.109３657）
５.ＩL—2ＤNA探针
6.其她试剂
（１）STE溶液0、1ｍoｌ/ＬNaCl
10mmｏl/LTｒｉｓ.Cl（pH８。
0）
１mmｏｌ/LEDＴA（ｐH8、0）
（２）溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖
25ｍｍoｌ／LTris.Cl（pH 8、0）
１0mmoｌ/ＬEDＴA（pH 8.０）
可配1０0ml,高压灭菌１5min,贮存于4℃
（3）溶液Ⅱ 0。
２mol／L NａOH（临用前用1０mｏl/L贮存液稀释）
1％SＤＳ（配20%贮存液）
盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物、于室温放置５~10ｍiｎ
（4） 溶液Ⅲ５mol/L乙酸钾6０mｌ
冰乙酸 11。
５ml
水28。
５mｌ
所配成得溶液对钾就是３ｍol/Ｌ,对乙酸根就是５mol/L
（5）含相应抗生素得ＬＢ培养基
（６）氯霉素（0。
2５g／２ml）－-—〉终浓度17０μｇ／ml
（7）溶菌酶（10mg/ml,溶于10mmol/L Tris、CｌpＨ8。
0）1ｍl
（8）无水乙醇（部分-２0℃预冷）。
异丙醇.75％乙醇（部分4℃预冷）
（9）ＴＥ缓冲液（ｐＨ８、0）
（１０）5mol/LLiCl１、5ml
（１1）RNＡ酶,RPMＩ-１640,胎牛血清（FＣS）,ConA（刀豆蛋白A）等
（12）500μl含13%（W/V）聚乙二醇（ＰEG 800）得1、6mｏｌ/LNaCｌ
（1３）３mol／LNaAｃ、饱与酚、氯仿:
异戊醇（24:
1）
（二）主要仪器
CO2培养箱:
美国FormaＳcｉentific产品;
无菌操作台:
苏州净化设备公司产品;
图象处理分析仪:
同济医大太阳公司产品;
低温高速离心机:
上海离心机械研究所.
（三）IL－2质粒DNＡ探针得大量制备
1、含IL-2质粒DNA探针得提取
取含IL-2质粒ＤＮＡ得单个菌落置两个25mlLＢ培养基（含100μg／mlＡｍp）
↓3７℃220r／min振摇过夜（约1６h）
取10ml菌液加200mlLB培养液（含1００μg/mlAmp）
↓37℃150ｒ/min振摇4ｈ
加氯霉素（终浓度17０μg/ｍl）
↓37℃220ｒ／min振摇3h
菌液倒入300mｌ离心管中离心
↓４℃５000r/ｍin×
10ｍｉｎ离心弃上清除去残液（吸水纸无菌）
每管加40ml SＴＥ溶液（冰预冷）悬浮细菌后,用移液管转入到５０ｍl离心管中
↓4℃5０００ｒ×
15ｍin离心
弃上清,加5ml溶液Ⅰ（冰预冷）悬浮细菌,加1ml新配制（ｐＨ8。
0）得溶菌酶（10mg/ml）
↓轻摇,室温静置5mｉn
加１0ml溶液Ⅱ,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器
↓冰浴10ｍin,且勿摇动
加7.5ml溶液Ⅲ（冰预冷）,轻振荡离心管数次使之混合
↓冰浴２０～３0ｍin,使沉淀完全,4℃１200０r/mｉn×
２0mｉｎ离心
取上清到另一5０ｍl离心管中,加0。
6体积异丙醇,混匀,室温静置15ｍｉn
↓室温500０ｒ/min×
15ｍin离心弃上清
用７5％乙醇洗涤沉淀一次（不将沉淀悬浮）,倒出乙醇,倒置吸水纸上,使乙醇挥发
用1.５mｌTE（ｐH8.０）将沉淀溶解,加等体积冰预冷得5MLiCｌ,混匀后置冰浴10ｍiｎ
↓４℃12000r/mｉｎ×
1０min离心
取上清至新EP管, 加等体积得异丙醇（约3mｌ）,充分混匀,室温静置15miｎ
↓室温１2000ｒmiｎ×
10ｍｉn离心（回收沉淀得核酸）
小心去上清,将管倒置以使最后残留得液滴流尽,用7５%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁得液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余得痕量乙醇蒸发
用500μlTE（ｐＨ8。
0）溶解DNA沉淀,移至新EP管中,加入RNA酶（终浓度100μg/ml）
↓３7℃水浴30mｉn
加等体积（500μｌ）含13％（W／V）ＰEＧ（800）得 1、６mol/LＮaＣl,充分混合
↓4℃120０0r/min×
５min离心
吸去上清,用4０0μlTE（pH８.0）溶解质粒DNＡ沉淀
加等体积饱与酚（400μl）混合
↓12０00r／min×
吸上层水相移至另一EＰ管,加入等体积酚:
氯仿:
异戊醇（25:
24:
1）剧烈混匀呈乳白状
↓1200０r/ｍin×
10min离心
吸上层水相移至另一ＥＰ管,加等体积氯仿:
1）混匀
↓120００r／min×
10mｉn离心
吸上层水相移至新EP管（硅化）,加入0.１体积得３ｍｏl/LNaAｃ（pH５、2）与2体积得—２0℃预冷得无水乙醇,混匀（可见沉淀出现）,置-20℃2ｈ或0℃20min
↓4℃12000r/min×
１５mｉn离心
弃上清,加7５%乙醇（４℃预冷）２00μl,稍加振荡,离心洗涤2次
↓4℃12０00r／ｍin×
5min离心去上清
敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见得痕量乙醇蒸发殆尽
溶沉淀于1１μl TＥ溶液中
↓ ↓
取1μl电泳其余进行酶切
、经0。
7%琼脂凝胶电泳,确定有质粒DＮＡ后,用ＸhｏI进行酶切、
酶切反应体系:
质粒DＮA10μｌ
XhｏＩ6μl
１０*Buffｅr（Ｈ）6μl
DＷ38μl
－－-－--－-—-—-—－—－-----－—
总体积６0μl３７℃消化过夜
3.用ＷｉｚａrｄTＭPCR纯化试剂盒回收ＩL—2 DNA片段
1）将6０μｌ酶切反应体系经１％琼脂糖凝胶电泳
2）紫外灯下切下ＩＬ-２DNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1ｍlRｅsｉn使凝胶溶化
3）用５ml一次性注射器将Ｒeｓin/ＤNAｍiｘ转移到WizardTＭMinicolumn中,用2ml8０%异丙醇洗涤Miniｃoluｍ,１２０00g离心20s,加50μlＤW到Ｍinicolumｎ中,12０0０g离心２0ｓ,收集ＤNA、
（四）用DNＡ 标记与检测试剂盒对IL—2探针进行地高辛标记地高辛就是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中得类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个11个碳原子得连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上得第5组碳原子相连接形成地高辛精标记得尿嘧啶核苷酸,BoehringｅrMannｈｅim公司出售得地高辛精标记核苷酸有dig—UTＰ,dig－dUTP,与diｇ—dｄUTＰ,它们分别适用于RＮA探针,DNA探针与寡核苷酸探针得标记。
地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针,用标记探针做原位杂交,杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。
在适宜得标记反应条件下,一般每2０～25个核苷酸中带有一个标记得核苷酸。
这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记得抗地高辛精之间得反应。
因为一个标记抗体大约复盖２０个核苷酸、BｏehringerMａnnhｅim公司生产得地高辛精DNA标记试剂盒与地高辛检测试剂盒在分子杂交中得应用愈来愈广泛。
现介绍地高辛标记ｃDNＡ探针随机引物延伸法。
１。
、将ＤNA（１μg～３μg）加热9５℃（或100℃）10mｉn,随即在冰/NaＣｌ中骤冷、DNA充分变性对探针标记十分重要。
５μl对照DNA作为对照。
２、将离心管置于冰上,按顺序加入下列试剂:
①1μg～3μg新鲜变性ＤNA;
②2μl六聚核苷混合物（试剂5）;
③２μldＮTP混合物（试剂6）,加入蒸馏水使总体积达到１9μl,再加入1μｌＫｌenow聚合酶。
３、离心片刻后,将离心管置3７℃恒温箱内孵育60mｉn。
延长孵育时间可长达２0 h,可使标记量增加、
4、加入2μl0、2ｍol/LＥDＴA （pH８。
0）终止酶反应。
5、加入2、５μｌ4mol／L ＬiCｌ与７5μl预冷（—２0℃）得乙醇,混匀置－7０℃3０min或-2０℃2h,使标记探针沉淀。
６、离心（16５0０ｒ/mｉｎ）,弃上清液,用50μl70％ 冷乙醇轻洗沉淀物。
7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于50μｌＴE缓冲液,-20℃冰箱保存。
（五）培养细胞RNA得提取（采用Trizol试剂盒提取RNA）
1、收集培养细胞,用RPMI－１64０培养液离心洗涤3次,第二次离心洗涤时用RPＭI-1６４0培养液调整细胞数至5×
１06～1×
１07细胞。
2、最后一次洗涤时吸1ｍl细胞悬液至1、5mlEＰ管中,在台式离心机离心,弃上清,加入1ｍｌTRＩZOL试剂,用移液器轻轻吹打细胞数次,充分混匀,室温（15～３0℃）静置5ｍｉn后,加入0、2ml氯仿,快速摇动1５s,室温静置2~3min、
3、于２～８℃离心1４６00r/ｍin×
１5ｍin,上层无色水相（RNA溶于此层中）约占整个细胞匀浆液得60％。
４、小心吸取其中40０μl移至另一Ｅppendorf管中,加入0、5ｍl异丙醇,轻柔混匀,室温静置5~1０miｎ后。
5、于2～８℃离心１４６０0r／min×
１0min,在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块,即为RNA。
弃上清。
6。
用冰冷得75％乙醇1ml洗RNＡ沉淀（不用吹打沉淀）,然后于2～8℃,115０0r/miｎ离心５min,去除上层乙醇后于无菌环境（或真空）风干ＲＮＡ沉淀,但不要使沉淀过于干燥,以免影响ＲNA得溶解,用20μlDEPC处理得双蒸水溶解RNＡ沉淀、置—8０℃冰箱备用、
（六）RNＡ得斑点杂交
１、RＮA变性:
2０μlRNA溶液（2μｇRＮＡ）
4μl20×
SSC
1４μl3７%甲醛（fｏｒｍaldehyde）
4０μｌ 100％甲酰胺
－—-—－———-—-－-－－---－--———－－-—－—-—-－－－
６0℃温育30ｍin,水浴冷却样品
在上述RＮA液体中每1００μl液中加21０μｌ 20×
SＳＣ（共３1０μl）,每孔加１50μl。
２、纤维素膜处理过程:
硝酸纤维素膜（0。
45μｍ）水中浸泡５miｎ,再用20×
ＳSＣ室温浸泡1h。
3、滤器得处理及点样:
用0.1NNaＯH浸泡（洗）多孔过滤加样器,再用灭菌水彻底冲液、将纤维素膜压在多孔加样器得上层板得上面,再压在下层板上,赶去气泡,然后两部分夹紧,点样前,先用２0×
SSC（2０0μl）洗一遍每个孔,真空抽吸干净后,再分别点样。
如有未点样孔须用150μl得２０×
SSC封住其孔,然后用真空泵抽吸干净,再用20×
ＳＳC清洗一次,待流体滤过纤维膜后,继续抽吸5min以干燥滤膜、
4、取出膜,８0℃烤2～3h,膜保存于-２0℃
配２0×
SSC标准柠檬酸盐pH ７、0
NaＣl175、3g
Nａ、Citrat 88、２g（柠檬酸钠）
Ｈ２O至1000ml
用10NNａＯH or１０NＨCｌ调pH至7.0,高压消毒
1NNaOH约0、5mｌ
５、杂交
（1）预杂交
1）预杂交液:
5×
SSＣ, 0、75％（Ｗ／V）封闭剂,0.1%（W/V）Ｎ—lauｒｏｙlｓarｃoｄine,0。
02％（W/Ｖ）SＤS
2）先将预杂交液热至６0℃。
３）将带有目得RＮＡ得硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜得塑料袋,加入预杂交液,按每100cｍ2滤膜加２０ｍl、
4）尽可能除净袋中得空气,用热封口器封住袋口,将其置６0℃水浴过夜,其间不断翻动塑料袋。
（2）杂交
１）杂交液（ＤIＧＥaｓyＨｙb（2０ｍl／10０cm2）预温轻振荡30min
2）将标记探针DNA（5~25ng/ml）煮沸变性５ｍin,迅速置冰水中冷却,
3）加入到预温得DIＧ EａｓyHyb（2。
5ml／100cｍ2）中混合,避免形成汽泡
4）然后每张膜上注入预杂交液与滴加探针／DＩGEａsy Hyｂ
５）振荡孵育至少6h,在微量ＤNA时,建议１6h,使其杂交。
6）２×
SＳC,0。
1%SDS清洗２次,每次5min,室温。
7）68℃振荡条件下,０。
1×
SＳＣ,0、１％SDS清洗２次,每次15min。
（七）免疫测定
1、杂交后彻底清洗,将膜置入清洗缓冲液中1~5ｍin。
2.、１０0ml封闭缓冲液（1×
）中封闭3０mｉn。
3、抗地高辛-AP复合物（75mU/mｌ）用封闭缓冲液（1×
）1∶10000稀释,
4、稀释得抗体溶液２0mｌ与膜孵育３０mｉn。
5、100ml清洗缓冲液中2次,每次１5ｍiｎ。
6、20ml测定缓冲液中平衡2~５min。
7、将膜置入新鲜制备得2０ml显色液中孵育５mｉn（暗处,即避光）,显色过程中避免振动。
8、数分钟显色沉淀开始形成,16h后反应完全,可短期在亮处观察显色情况
９、如果可见期望得斑点,加TE缓冲液50ｍl作用5ｍin终止显色（缓冲液4）。
（八）图象分析结果用MＰIAS－500多煤体彩色图文分析系统,以0.7８5μm图查点长,在1、７15×
10５μm2测量窗下测得各斑点得积分光密度值,以标准参数作图查得各样本得数值或将各组积分光密度值进行比较。
（九）注意事项
核酸探针得标记及杂交就是一个很复杂得过程, 步骤多耗时长, 影响因素多。
要想获得理想结果,每一步都应严格操作。
1、严格操作标记与杂交得各种溶液应高压灭菌;
含SＤS, Tween20得溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液;
使用灭菌吸头、干净平皿,每次用前必须严格清洗、操作膜时戴无尘手套;
只用无齿镊操作膜得边缘。
原位杂交得每步反应均应加盖硅化得盖玻片
２、标记反应注意事项
（1）随机引物标记前必须将探针变性:
10０℃沸水浴１0分钟后,迅即插入冰中,缺口平移则不需变性。
（2）DNA片段必须小于1０Kb。
大于10ＫB得DＮA序列则需要酶切。
最小能为随机法
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