单链抗体研究进展样本.docx

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单链抗体研究进展样本

抗体工程课程论文

单链抗体研究进展

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-上半年

单链抗体研究进展

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摘要：

单链抗体作为一种小分子基因工程抗体，在理论和应用方面研究引起了广泛关注，其在显像定位诊断、靶向治疗和参加细胞免疫等方面展示出了可观应用前景。

本文对单链抗体构造及特点、制备技术及其应用研究进展等进行了综述，以期可觉得单链抗体进一步进一步研究和应用提供理论基本。

核心词：

单链抗体；构造；制备技术；应用

Abstract:

Micro-moleculeantibodypreparedbygeneticengineeringhaveattractedwideattentions.Anditshowedconsiderableapplicationprospectsinimaginglocalizationanddiagnosis，targetedtherapyandcellularimmunity.Thestructure，characteristicsandpreparationtechnologyofsingle-chainantibodyaswellasitsapplicationswerereviewed，soastoprovidetheoreticalfoundationforfurtherstudyonsingle-chainantibodyanditsapplications.

Keywords：

single-chainantibody；structure；preparationtechnology；application

前言：

机体在受到抗原物质刺激后，B淋巴细胞或记忆B细胞增殖分化形成浆细胞，产生免疫球蛋白能与抗原发生特异性结合，辨认并清除外来入侵物质。

防御系统中抗体不可或缺，是维护机体生理平衡和稳定重要构成某些之一［1］，因而,人们对抗体制备、纯化技术进行了长期摸索。

初期使用老式办法以天然抗原免疫实验动物，产生相应多克隆抗体。

该办法获得抗体重要用于治疗某些感染性疾病，但因其存在均一性差、交叉反映多、易产生副作用等缺陷而限制了其大规模生产应用。

1975年以来，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体与多克隆抗体相比，具备性质均一、特异性强、容易生产等长处，现已在科学研究、临床诊断与治疗等方面发挥着重要作用。

但由于制备周期较长，操作难度高，抗体自身稳定性差,在人体内重复应用时会发生人抗鼠抗体反映（humanandanti-mouseantibody，HAMA），而大大减少了治疗效果，因而使得其在临床治疗中应用困难重重。

20世纪80年代初，随着基因工程抗体成功研制，抗体研究进入了新发展阶段。

此后，人们尝试运用基因工程技术大量生产重组抗体，通过基因工程办法在基因水平对免疫球蛋白分子进行加工、修饰，开发了大量可用于研究、诊断、治疗小分子抗体。

这些抗体不但保存了天然抗体生物学活性和特性，同步也去除了大某些无关构造，使其更加适合体内诊断和治疗。

单链抗体（single-chainantibodyfragment，scFV）以其分子量小、穿透性强、亲和力高等优势,引起人们越来越多关注和研究。

1scFV构造和特点

scFV是将抗体重链可变区（variableregionofheavychain,VH）和轻链可变区（variableregionoflightchain,VL）通过15～25个氨基酸短肽（linker）首尾连接而成重组蛋白，是亲代抗体所有抗原结合特异性最小功能构造单位。

与老式抗体相比,scFV存在如下几方面优势：

①分子质量小；②较好地保存了原抗体结合位点构型、位置及其对抗原亲和活力和精确度；③有较好穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触、接合，合用于肿瘤诊断和治疗；④易于进行分子改造，可直接杀伤靶细胞；⑤可由恰当大肠杆菌进行大批量生产；⑥可绕过常规抗体制备程序，获得常规办法难以实现人源性抗体和毒素类抗体［2］。

固然，scFV也存在某些缺陷，如分子量小，免疫系统对抗体清除速度快，难以达到诊断或治疗所需时间；构造简朴,亲和力低,稳定性差等。

2scFV制备技术

2.1噬菌体展示技术近年来，噬菌体成为展示scFV重要平台。

噬菌体展示技术是借助基因工程，使scFV片段与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合，从而将scFV表达于噬菌体表面，便于进一步鉴定与筛选。

黄爱玲等［3］通过RT-PCR技术扩增出轻链和重链片段，并运用噬菌体展示技术构建了兔天然抗体库，为开展兔免疫系统、抗体构造与性质等方面进一步研究提供了可靠保障。

李楠等人[4]成功构建人源性阿尔茨海默病（AD）噬菌体单链抗体（scFV）库，为筛选β-淀粉样蛋白人源性抗体奠定了基本。

以及刘琼等人[5]成功从大容量甲状腺髓样癌（MTC）人原噬菌体单链抗体库中筛选出特异抗MTC单链抗体，并对其生物学特性进行鉴定。

2.2核糖体展示技术核糖体展示技术具备诸多长处，如亲和力高、展示速度快、简便易行、不受细菌转化效率影响等，从而缩短了实验周期。

核糖体展示技术是一种高效体外筛选scFV办法，重要过程是使新生scFV与其mRNA连接形成复合物,富集与抗原具备高亲和性mRNA，再通过PCR反转录得到扩增产物。

但在此过程中若未对DNA聚合酶进行功能校对，则较容易发生基因突变［6］。

2.3酵母表面展示技术酵母表面展示是筛选具备高特异性和亲和力scFV有力办法,但由于酵母转化效率低，使得实验周期变长，因而限制了筛选抗体种类和产量。

酵母表面展示技术核心是将重组蛋白连接到酵母细胞壁上。

例如，蛋白质可以通过与α-凝集素黏附受体融合展示在酵母菌细胞壁上［7］。

该技术充分运用了酵母细胞内质网,使得重组蛋白在内质网中可以精确折叠。

3scFV应用

scFV具备分子质量小、体积小、无Fc构造域等长处，使得其在许多领域具备较为辽阔应用前景。

3.1scFV在肿瘤治疗方面应用

3.1.1靶向治疗：

肿瘤靶向治疗是scFv最直接应用领域。

由于其具备免疫原性低、靶向性好、穿透力强、副作用小等长处，因而在靶向治疗中具备独特优势。

如抗体导向酶—前药疗法（antibody-directedenzymeprodrugtherapy，ADEPT），就是将scFv与药物活化酶在体外进行连接，再将无活性或低活性前药静脉注射入人体，与抗体连接酶在肿瘤细胞处激活前药活性，避免了脱落抗原与之结合在肝肾，导致堆积，而使得肿瘤组织内药物大量富集。

当前，scFV对肿瘤治疗研究，已在靶向脂质体、免疫毒素、靶向性病毒载体及scFV融合蛋白等方面获得了一定进展。

德国学者Castoldi等［8］研制出一种特殊双特异性scFV，可以通过阻碍表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）和Met发挥作用，从而抑制肿瘤细胞生长。

CD133是一种人体内异常scFV，可用于肿瘤靶向治疗。

当前，研究人员已经探明了其表达方式［9］。

免疫毒素则运用scFv与毒素连接，进而提高毒素免疫杀伤力。

免疫毒素分子可特异性地辨认并杀死靶细胞。

scFV与毒素偶联后一方面通过scFV与靶细胞表面抗原结合，经内化后毒素进入靶细胞引起肿瘤细胞凋亡［10］，在保存病毒对肿瘤细胞杀伤力同步，也提高了病毒载体靶向性。

3.1.2影像分析：

通过放射性同位素标记scFV在进行肿瘤影像学分析时，将针对肿瘤有关抗原或肿瘤特异性抗原标记抗体注入体内，拟定肿瘤位置，然后再依托产生内照射效应达到放射性免疫治疗作用［11］。

scFV分子量较小，可以迅速、高效地渗入肿瘤细胞内部［12］，使肿瘤定位图像明确、清晰，同步也避免了非特异性损伤，因而其具备高效特异性和亲和力，以及远高于常规抗体清除率［13］。

3.1.3肿瘤治疗其她方面：

双特异性抗体不但可以辨认肿瘤细胞，也能消灭肿瘤细胞。

Gomes［14］等把scFV基因与编码亲和素基因连接，使嵌合蛋白形成四聚体复合物，可结合抗原与生物素，因而可运用ELISA和免疫印迹技术直接检测抗原。

Anti-CHMP5单链可变区抗体片段逆转录病毒可以感染并诱发细胞程序性死亡［15］，如可消灭AML白血病细胞。

Patel等［16］于年研制出一种重组scFV,可通过对抗错误折叠超氧化物歧化酶消灭腺病毒。

3.2scFV在抗病原生物领域研究

3.2.1在抗病毒方面应用：

流感病毒（influenzavirus）重要通过空气传播，引起人畜共患呼吸道传染病。

每年大规模爆发季节性流感对人类健康及经济发展产生了巨大影响［17］。

而流感病毒变异快特点使得设计、生产具备广泛交叉保护作用疫苗成为人们研究重要内容。

伪狂犬病毒是一种疱疹病毒，能通过胎盘、呼吸道和消化道等进行传播，引起哺乳动物和某些禽类发热、精神沉郁甚至死亡。

近年来，国内在猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）重组疫苗研究上获得了重大突破。

郭广君等［18］运用scFV技术构建了猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株。

曾伟伟等［19］建立了scFV文库，获得了针对呼肠弧病毒VP4scFV，为进一步研究该病毒与细胞互相作用提供了有力支持。

刘金凤等人[20]运用抗猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）单链抗体基因（ScFv）建立CSFV病原迅速检测办法，成功构建了CSFV-ScFv基因。

3.2.2在抗细菌方面应用：

近年来，scFV在抗植物、动物致病性细菌方面研究与应用也获得了较大进步。

殷幼平等［21］运用scFV技术对柑橘溃疡病进行迅速免疫诊断,为制备病害治疗性抗体提供了有效方案。

王报贵等［22］运用基因工程办法成功地获得了抗肠炎沙门菌scFV。

3.2.3在抗寄生虫方面应用：

通过生物工程技术进行批量生产进一步人源化scFV，并将其应用到疟疾诊断和治疗方面，是近年来scFV在抗寄生虫方面研究热点，如何卓等［23］成功地构建了日本血吸虫未成熟卵scFV库。

3.3自身免疫疾病研究风湿、艾滋病等自身免疫疾病产生机理也与自身抗体合成关于。

非正常机体会自发产生高亲和力自身抗体，同步在ADCC作用或激活补体系统等机制影响下产生病变。

scFV在HIV治疗方面具备巨大潜力［24］。

Yang和Wang［25］运用基因工程技术，在体外大量制备了b12-scFV，并将其应用于艾滋病被动免疫防治；杨雄等［26］合成并克隆了HIV-1可溶性单链抗体b12-scFV，并在大肠杆菌中诱导表达,为设计新型、有效HIV-1疫苗奠定了基本。

3.4scFV在食品安全面应用

3.4.1在毒素检测方面应用：

在食品工业生产中，黄曲霉、寄生曲霉等产生黄曲霉毒素真菌检测涉及食品安全性，一旦浮现问题就会威胁到消费者健康。

因而，开发精确检测黄曲霉等真菌办法至关重要。

廖玉才［27］等运用噬菌体展示技术，从抗体库中提取出对黄曲霉具备特异辨认性scFV，并将其与碱性磷酸酶连接进行真菌检测。

该办法在保证检测成果精确同步，又能保持持续几代批次高保真性，在保持抗体活性及检测成本等方面具备极大优势。

3.4.2在农、兽药残留检测方面应用：

农产品中药物残留检测对公共卫生安全具备重要意义。

采用基因重组抗体技术，可获得用于兽药多残留迅速免疫分析广谱性抗体，使兽药残留检测分析技术更加高效、快捷［28］。

寇立泉［29］构建了有机磷杀虫剂抗体库，建立了检测食品中有机磷迅速、有效办法。

5展望

scFV由于具备分子质量小、体积小、无Fc构造域等性