牛尾七开口箭对B16BL6黑色素瘤转移作用影响分析与研究Word文档下载推荐.docx
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关键词：
开口箭黑色素瘤B16-BL6肺转移单细胞悬液解剖显微镜人工基底膜插入式培养皿培养基。
Abstract
EffectsofTupistrachinensisBakontransferofMelanomaB16-BL6
PartoneExperimentonspontaneousmembranetransferoflunginmelanomaB16-BL6.
ObjectivetostudytheinhibitionofTupistrachinensisBakonmelanomaB16-BL6aboutpulmonarymetastasis.
MethodsTakeMelanomaB16-BL6whichisinlogarithmgrowingperiodthroughcultivationinextraorgan.Makemonoplastsuspension.ToplantmelanomaB16-BL650ul（2×
107/ml）onrightpost-calwofmouseC57BL/6N.Dividefivegroupinradom.ControlgroupofMascclineisTaxol（4.5mg/kg）.Controlgroupoffeminineisphysiologicalsaltwater.Thedoseofadministeringdrugis15mg/kg,30mg/kg,45mg/kg.Afterthreeweeks,cellsapoftumorareplantedtotheanimals,whenthebulkoftumorovertake10cubicmillimeter,anesthesiamousewithdiethyl.Inasepsiscondition,ablateaffectedlimb,aftertwoweeks,toputthemousetodeath.Takeoutoflungandfixwithformaldehyde.Countthenumberoftumortubercleofsuper-lunginanatomicalmicroscope.UseU-analysistohandledatainstatistics.
Results:
DifferentdoseofTupistrachinensisBakhavesomedepressanteffectongrowthofmelanomaB16-BL6.Themoderatelydose（30mg/kg）andlowdose（15mg/kg）haveamanifesteffectbecausetheyhaveastastisticsmeaning,comparedwithcontrolgroup（p<
0.05）.ThelowdoseandthemoderatelydoseofTupistrachinensisBakalsohavesomedepressanteffectontransferoflungofmelanomaB16-BL6.
Parttwo:
Experimentoninfiltrationofrecombinatingartificialbasalmembraneinextraorgan.ObjectivetostudytheinhibitionofTupistrachinensisBakonmelanomaB16-BL6aboutinfiltrationofrecombinatingartificialbasalmembraneinextraorgan.
MethodsdigestmelanomaB16-BL6whichisinlogarithmgrowingperiodwithEDTAandarraymonoplastsuspensionwhoseconcentrationis2×
106/ml.FiltermembranePVPFispastedonTranswell.Overlay5ugofh-FNandMGoneachsideoffiltermembrane.Afterairdry,adddifferentconcentrationofTupistrachinensisBakinmonoplastsuspension.Incontrolgroupbycontrast,addphysiologicalsaltwaterwiththesamevolume.Putnutritivemediumwhichinclude0.1%BSA-1640intotheboardoftwenty-fouraperture.Eachapertureisaddednutritivemedium500ul.Wipeoutartificialbasalgumwithcottonpick.Cultivatethem24hoursinincubatorwith37centi-degreeand5%CO2.Fixfiltermembranewithformaldehyde.DrumwithHEinroutineandmount.Countthenumberoftumorfivevisualfieldsinopticsmicroscopiclens（400times）.Calculategeneralaverageofinfiltrationcellineachvisualfields.UseU-analysistohandledatainstatistics.
ResultsDifferentdoseofTupistrachinensisBakhavesomedepressanteffectonginfiltrationofmelanomaB16-BL6.Thenumberofcellinfiltrationofthemoderatelydosehaveastastisticsmeaning,comparedwithcontrolgroup.（p<
0.05）
[keywords]TupistrachinensisBak;
melanomaB16-BL6;
pulmonarymetastasis;
monoplastsuspension;
anatomicalmicroscope;
artificialbasalmembrane;
Transwell;
nutritivemedium;
前言
恶性肿瘤是威胁人类生命的重大疾病之一，病因复杂，与遗传，生活习惯，饮食等有关。
近年来世界各国对肿瘤的治疗很重视，特别是肿瘤的药物治疗。
药物治疗不只限于细胞毒类药物，生物导弹类药物及基因类药。
目前中药类药物的抗肿瘤作用也越来越受到人们的关注。
药物的疗效是药物筛选的重要方面，筛选出疗效好，副作用少，毒性低，价格便宜的药物是药物筛选的直接目的。
肿瘤的无限增殖，浸袭及转移，血管的生成都可为药物筛选提供方向。
肿瘤的浸袭及转移是肿瘤难治的最重要原因，因此它是肿瘤药物的疗效筛选的中心。
黑色素瘤是常见的恶性肿瘤，恶性程度高，又称恶性黑瘤。
大多原发于皮肤，也可起源于眼，鼻腔等处，早期可发生转移，转移部位多见于肺，脑。
所以预防黑色素瘤的早期转移是治疗的有效手段。
中草药是中华民族医药宝库，它有数千年的悠久历史，开发和利用这一宝库不仅发扬我国优良文化传统，也是全人类可利用的宝贵资源。
开口箭系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药，主治劳热咳嗽，跌打损伤，风湿弊痛等症。
民间用于治疗咽喉炎，扁桃体炎等。
开口箭含有甾体皂甙和甾体皂甙元，且含量较高。
皂苷甙具有增强免疫功能，抗辐射，抑制肿瘤生长，抗炎，降血糖等广泛的生物活性，近年来受到人们的普遍关注。
有研究证实开口箭同属植物皂甙成分有细胞毒活性。
但是关于开口箭的体内外抗肿瘤作用的动物实验研究尚未报道。
开口箭提取物总皂甙报道有细胞毒作用，人参皂甙Rg3具有促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤生长、抗肿瘤粘附、侵袭和转移、抑制肿瘤新生血管形成作用,同时,具有与化疗药物联合应用的减毒增效作用,提高机体免疫力,逆转肿瘤细胞的多药耐药性等作用。
上述提示皂甙及其衍生物有抗肿瘤的作用。
侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征,是导致癌症患者临床死亡的主要原因。
因此,阻止肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤治疗成败的关键因素。
B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6细胞移植于动物局部,瘤体增殖生长后,侵袭周围正常组织和血管,进入血循环,到达远处部位发生肿瘤转移。
此模型可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵袭的完整转移过程。
基于以上知识和研究背景，本课题通过B16-BL6黑色素瘤自发肺转移实验和体外重组人工基底膜浸袭实验来初步探讨开口箭是否具有抗肿瘤作用和是否有抑制肿瘤转移的作用。
通过药效的观测为新药的开发和进一步的研究提供理论基础。
实验一
B16-BL6黑色素瘤自发肺转移实验
1材料与方法
1.1实验药品
1）开口箭总皂甙武汉同济现代医药有限公司
2）紫衫醇注射液（Taxol）上海海曲化工有限公司
1.2实验用B16-BL6黑色素瘤高转移株
B16-BL6黑色素瘤高转移株，由华中科技大学同济医学院细胞生物工程实验室提供
1.3实验动物
昆明种小鼠50只，体重20g±
2.2g,雄性，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.4实验模型的建立
1）黑色素瘤B16-BL6细胞培养，取对数生长期黑色素瘤B16-BL6细胞制备单细胞悬液.
2）种植前，用注射器吹打均匀，以保证种植入每只小鼠体内的细胞数基本相等。
3）昆明种小鼠右后爪垫皮下接种植50ul（含2×
107个/ml）的黑色素瘤B16-BL6细胞。
4）接种瘤细胞液,随机分为5组。
5）动物接种黑色素瘤B16-BL6细胞液后3周，当瘤体>
10mm3时,将小鼠用乙醚麻醉,无菌条件下切除患肢，止血，包扎。
1.5实验分组
将实验动物随机分为五组，每组10只，包括开口箭三个剂量组，一个阴性对照组及一个阳性对照组，具体分组如下：
1高剂量组45mg/kg编号为A
2中剂量组30mg/kg编号为B
3低剂量组15mg/kg编号为C
4阳性对照组：
紫衫醇注射液4.5mg/kg编号为D
5阴性对照组：
生理盐水135mg/kg编号为E
1.6给药方法
腹腔注射给药，在给实验动物种植黑色素瘤B16-BL6细胞后，第二天开始给药，每周给药一次，共五周。
1.7评价指标及方法
种植黑色素瘤B16-BL6细胞后，在第三周后小鼠爪下长出瘤体后，切除患肢，对截下的原发灶后肢称重,并按照公式抑瘤率（%）=（1－实验组平均原发灶后肢重/对照组平均原发灶后肢重）×
100%来计算抑瘤率。
继续给药2周,处死动物,称体重。
解剖取肺﹑脾、胸腺并用10%甲醛溶液固定组织。
在解剖显微镜下计数肺﹑脾、胸腺组织表面肿瘤结节数,比较各组动物肺转移灶数目及转移率。
1.8统计学处理
用SPSS软件对所得数据进行统计学处理，所有数据以（
±
s）
2实验结果
如表（1，2）和图（1，2,3）所示，三周后小鼠右后爪下长出肿瘤,B﹑C﹑D组对小鼠B16-BL6黑色素瘤生长和转移有抑制作用（P<
C﹑D组对小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移率有抑制作用。
表1开口箭总皂甙对小鼠B16-BL6黑色素瘤生长的影响（
s,n＝10）
组别
小鼠数量
剂量mg/kg
后肢重（g）
抑瘤率（%）
A组
10
45mg/kg
0.589±
0.214
18.53%
B组
30mg/kg
0.426±
0.208﹡
41.08%
C组
15mg/kg
0.503±
0.157﹡
30.44%
D组
4.5mg/kg
0.434±
0.213﹡
39.97%
E组
135mg/kg
0.723±
0.232
﹡与对照组（E组）比较P<
0.05,有显著性差异
图1.三周后小鼠长出肿瘤，表示造模成功
表2开口箭对B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性肺转移的影响
剂量
肺转移结节数
总转移结节数
肺转移率（℅）
A组
8.87±
0.20
13.42±
0.41
66.02±
1.46
8.14±
0.32﹡
12.29±
0.38￥
66.33±
1.72
15mg/kg
7.16±
0.27﹡
12.76±
0.27￥
58.36±
1.40★
4.5mg/kg
7.43±
0.22﹡
12.14±
0.29￥
59.52±
1.38★
135mg/kg
10.6±
0.23
15.67±
0.32
68.71±
1.53
﹡表示肺转移结节数与E组肺转移结节数相比较P<
＃表示总转移结节数与E组总转移结节数相比较P<
0.05,有显著性差异
★表示肺转移率（℅）与E组肺转移率（℅）相比较P<
0.05,有显著性差异
图二各组别对B16-BL6小鼠黑色素瘤结节数的影响
*表示总转移结节数与对照组（E）比较（P<
0.05）,有显著性差异
￥表示肺转移结节数与对照组（E）比较（P<
图三各组别对B16-BL6小鼠黑色素瘤肺转移率的影响
*表示肺转移率与对照组（E组）（P<
实验二体外重组人工基底膜浸袭实验
1材料和方法
1．1实验用品
1）Transwell小室Costar公司提供
2）人工基底膜胶BD公司提供
3）开口箭武汉同济现代医药有限公司
4）牛血清白蛋白武汉天源生物技术有限公司
1.2实验用B16-BL6小鼠黑色素瘤高转移株由华中科技大学同济医学院细胞工程室提供
1.3实验的步骤
增殖期的B16-BL6黑色素瘤细胞用EDTA消化,配制成2107个/ml的细胞悬液,细胞悬液加无血清培养基，各取500ul加入Transwell小室内，下层加含20%胎牛血清并含0.1%牛血清白蛋白培养基500ul在24孔板内，然后加入不同浓度的开口箭和对照的生理盐水，37℃,5%CO2温箱内培养4小时,将滤膜用甲醇固定,常规HE染色﹑封片,在光学显微镜下选择滤膜随机选5个不同视野,计数每个视野侵袭细胞数，计算平均值和细胞侵袭抑制率，实验重复4次。
1．4实验的原理
由于上层是无血清培养基，下层是含20%胎牛血清并含0.1%牛血清白蛋白培养基，因为营养梯度加上B16-BL6黑色素瘤的高浸袭及转移能力，同时由于Transwell小室内的h-FN和MG的趋化作用，B16-BL6黑色素瘤会穿过人工基底膜胶到达人工基底膜的下层并贴壁。
加入不同的药物与对照组进行对比，来观测药物的抑制B16-BL6黑色素瘤转移的作用。
1.5实验给药的剂量
实验分四组，每组5个，分为
高剂量组加0.6%的开口箭100ul（A）
中剂量组0.2%的开口箭100ul（B）
低剂量组为0.1%的开口箭100ul（C）
0.9%生理盐水100ul（D）
1.6实验评价指标
光学显微镜下选择滤膜上下左右中5个不同视野,计数每个视野侵袭细胞数,计算平均值，通过公式IR（%）=（1－实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数）×
100%计算药物对细胞侵袭的抑制率。
2实验结果
如表3所示,B组B16-BL6细胞侵袭重组基底膜有抑制作用，抑制率为21.46％。
表3开口箭对B16-BL6细胞侵袭重组基底膜的影响
数量
细胞数
抑制率（%）
5
0.6mg
49.8±
4.3
4．59%
0.2mg
41.0±
4.7﹡
21．46%
0.1mg
47.5±
4.8
9．01%
0.9mg
52.2±
6.6
﹡与对照组（D组比较）P<
0.05,有显著性差异性
讨论
肿瘤是威胁人类健康的大敌之一,抗肿瘤的研究一直是医学研究的热点,目前治疗肿瘤仍采用手术、放疗及化疗等方法。
中药的抗肿瘤作用也日益引起关注,应用中药进行综合调节治疗也是近年研究的热点,中药及其复方在抑制、杀伤肿瘤细胞,改善症状与体征,以及减轻放化疗不良反应方面,都发挥着重要作用。
中药抗肿瘤作用通过很多途径如中药及其复方可以通过诱导细胞因子产生、抑制酪氨酸激酶的活性和抑制突变等多种分子机制发挥抗肿瘤效应。
Assinewe等[1]研究发现,从人参根部提取的多糖,能明显刺激肺巨噬细胞分泌TNF,从而通过直接杀伤肿瘤细胞、阻断肿瘤组织血供、激活机体免疫系统等途径发挥抗肿瘤作用。
Ikken等[2]通过Ames试验证明,猕猴桃乙醇提取物可阻断强致癌物N2亚硝基化合物（NOC）的合成,对亚硝基二甲胺（HDMA）、亚硝基二丁胺（NPYR）、亚硝基吡咯烷（NDBA）、亚硝基哌啶（NPIP）均有阻断作用,其中对NDBA的阻断率可达51%,提示猕猴桃对NOC所致的突变性有明显的抑制作用。
有报道开口箭提取物有抗肿瘤作用，开口箭属植物所含化学成分多为甾体皂甙类化合物，均含有甾体皂甙和甾体皂甙元[3]，并有研究证实开口箭属植物皂甙类化合物有细胞毒活性[4-6]。
皂甙是许多中药的有效成分，如人参皂甙有抗肿瘤作用人参皂甙Rg3简称（Rg3）是从红参中微量提取的人参皂甙的一种化学成分,研究表明,Rg3对血行转移的肿瘤细胞的增殖、浸润及转移等具有抑制作用[7-12]。
同时皂甙还有许多其他药理作用如在学习和记忆的改善作用与抗衰老的有一定的作用[[[13]，有抗肝毒性[14]。
对糖尿病有治疗作用[15]。
侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征，是导致癌症患者临床死亡的主要原因。
B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6细胞移植于动物局部,瘤体增殖生长后,侵袭周围正常组织和血管,进入血循环,到达远处部位发生肿瘤转移。
此模型可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵袭的完整转移过程[16]。
本实验在体实验表明,与对照组相比,开口箭高、中，低剂量组肺转移率都有所降低。
开口箭低剂量组小鼠与对照组相比结节明显减小,肺转移程度减轻（P<
0.05）,表明开口箭能够在一定程度上抑制黑色素瘤的转移。
体外实验表明,对B16-BL6细胞侵袭重组基底膜能力有一定的抑制作用。
开口箭的抗肿瘤作用机制有待进一步的研究。
天然产物研究与利用湖北省重点实验室·
三峡大学化学与生命科学学院李青,邹坤等证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高[16]，开口箭的抗肿瘤作用与其药效成分总皂苷有关。
而皂苷的抗肿瘤作用机制已经有一些报道。
如皂苷有促进肿瘤细胞的凋亡的作用。
富力、鲁岐在细胞增殖动力学研究中观察到20（R）2人参皂甙
Rg3促进肿瘤细胞凋亡而产生凋亡峰。
大量抗癌药物是通过诱导细胞凋亡发挥其细胞毒作用。
所以,细胞凋亡是临床上体现对肿瘤实施化疗和放疗效果的一个重要标志,陈俊霞等[17]通过人参皂甙Rg3诱导膀胱癌细胞系EJ的凋亡作用的研究发现Rg3可通过诱导EJ细胞凋亡而发挥其抑制细胞增殖的作用。
姜淑华等[18]采用
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