牛尾七开口箭对B16BL6黑色素瘤转移作用影响分析与研究Word文档下载推荐.docx

1、关键词：开口箭 黑色素瘤B16-BL6 肺转移 单细胞悬液 解剖显微镜 人工基底膜 插入式培养皿 培养基。AbstractEffects of Tupistra chinensis Bak on transfer of Melanoma B16-BL6Part one Experiment on spontaneous membrane transfer of lung in melanoma B16-BL6.Objective to study the inhibition of Tupistra chinensis Bak on melanoma B16-BL6 about pulmona

2、ry metastasis .Methods Take Melanoma B16-BL6 which is in logarithm growing period through cultivation in extraorgan .Make monoplast suspension. To plant melanoma B16-BL6 50ul（2107/ml） on right post-calw of mouse C57BL/6N. Divide five group in radom. Control group of Masccline is Taxol（4.5mg/kg）. Con

3、trol group of feminine is physiological salt water. The dose of administering drug is 15mg/kg, 30mg/kg, 45mg/kg .After three weeks ,cell sap of tumor are planted to the animals, when the bulk of tumor overtake 10 cubic millimeter, anesthesia mouse with diethyl. In asepsis condition, ablate affected

4、limb, after two weeks, to put the mouse to death. Take out of lung and fix with formaldehyde. Count the number of tumor tubercle of super- lung in anatomical microscope. Use U-analysis to handle data in statistics.Results: Different dose of Tupistra chinensis Bak have some depressant effect on growt

5、h of melanoma B16-BL6. The moderately dose （30mg/kg） and low dose （15mg/kg） have a manifest effect because they have a stastistics meaning, compared with control group （p0.05）. The low dose and the moderately dose of Tupistra chinensis Bak also have some depressant effect on transfer of lung of mela

6、noma B16-BL6. Part two: Experiment on infiltration of recombinating artificial basal membrane in extraorgan. Objective to study the inhibition of Tupistra chinensis Bak on melanoma B16-BL6 about infiltration of recombinating artificial basal membrane in extraorgan. Methods digest melanoma B16-BL6 wh

7、ich is in logarithm growing period with EDTA and array monoplast suspension whose concentration is 2106/ml. Filter membrane PVPF is pasted on Transwell. Overlay 5ug of h-FN and MG on each side of filter membrane. After air dry, add different concentration of Tupistra chinensis Bak in monoplast suspe

8、nsion. In control group by contrast, add physiological salt water with the same volume. Put nutritive medium which include 0.1%BSA-1640 into the board of twenty-four aperture. Each aperture is added nutritive medium 500ul. Wipe out artificial basal gum with cotton pick .Cultivate them 24 hours in in

9、cubator with 37 centi-degree and 5%CO2. Fix filter membrane with formaldehyde. Drum with HE in routine and mount. Count the number of tumor five visual fields in opticsmicroscopic lens （400 times）. Calculate general average of infiltration cell in each visual fields. Use U-analysis to handle data in

10、 statistics.Results Different dose of Tupistra chinensis Bak have some depressant effect on g infiltration of melanoma B16-BL6. The number of cell infiltration of themoderately dose have a stastistics meaning, compared with control group. （p10mm3时, 将小鼠用乙醚麻醉, 无菌条件下切除患肢，止血，包扎。 1.5 实验分组将实验动物随机分为五组，每组10

11、只，包括开口箭三个剂量组，一个阴性对照组及一个阳性对照组，具体分组如下：1 高剂量组45mg/kg编号为A 2 中剂量组30mg/kg编号为B 3 低剂量组15mg/kg编号为C4阳性对照组：紫衫醇注射液4.5mg/kg编号为D5阴性对照组：生理盐水135mg/kg编号为E 1.6 给药方法 腹腔注射给药，在给实验动物种植黑色素瘤B16-BL6细胞后，第二天开始给药，每周给药一次，共五周。 1.7 评价指标及方法 种植黑色素瘤B16-BL6细胞后，在第三周后小鼠爪下长出瘤体后，切除患肢，对截下的原发灶后肢称重, 并按照公式抑瘤率（%）=（1实验组平均原发灶后肢重/对照组平均原发灶后肢重）100

12、%来计算抑瘤率。继续给药2 周, 处死动物, 称体重。解剖取肺脾、胸腺并用10%甲醛溶液固定组织。在解剖显微镜下计数肺脾、胸腺组织表面肿瘤结节数, 比较各组动物肺转移灶数目及转移率 。 1.8 统计学处理 用SPSS软件对所得数据进行统计学处理，所有数据以（s） 2 实验结果 如表（1，2）和图（1，2, 3）所示，三周后小鼠右后爪下长出肿瘤, BCD组对小鼠B16-BL6 黑色素瘤生长和转移有抑制作用（PCD组对小鼠B16-BL6 黑色素瘤肺转移率有抑制作用。表1 开口箭总皂甙对小鼠B16-BL6 黑色素瘤生长的影响（s,n10） 组 别小鼠数量剂量mg/kg后肢重（g） 抑瘤率（%）A 组

13、 1045mg/kg0.5890.214 18.53%B 组30mg/kg0.4260.208 41.08%C 组 15mg/kg0.5030.157 30.44%D 组 4.5mg/kg0.4340.213 39.97%E 组 135mg/kg0.7230.232 与对照组（E组）比较P0.05, 有显著性差异图1. 三周后小鼠长出肿瘤，表示造模成功表2开口箭对B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性肺转移的影响剂 量肺转移结节数总转移结节数肺转移率（）A 组8.870.2013.420.4166.021.468.140.3212.290.38￥66.331.7215mg/kg7.160.2712.

14、760.27￥58.361.404.5mg/kg7.430.2212.140.29￥59.521.38135mg/kg10.60.2315.670.3268.711.53 表示肺转移结节数与E组肺转移结节数相比较 P 表示总转移结节数与E组总转移结节数相比较 P0.05, 有显著性差异 表示肺转移率（）与E组肺转移率（）相比较 P0.05, 有显著性差异 图二 各组别对B16-BL6小鼠黑色素瘤结节数的影响 * 表示总转移结节数与对照组（E）比较（P0.05）, 有显著性差异 ￥ 表示肺转移结节数与对照组（E） 比较（P 图三 各组别对B16-BL6小鼠黑色素瘤肺转移率的影响 *表示肺转移率与

15、对照组（E组） （P实验二 体外重组人工基底膜浸袭实验 1 材料和方法 11 实验用品 1）Transwell小室 Costar公司提供2）人工基底膜胶 BD公司提供3）开口箭 武汉同济现代医药有限公司 4）牛血清白蛋白 武汉天源生物技术有限公司 1.2 实验用B16-BL6小鼠黑色素瘤高转移株 由华中科技大学同济医学院细胞工程室提供 1.3 实验的步骤 增殖期的B16-BL6黑色素瘤细胞用EDTA消化,配制成2107个/ml的细胞悬液, 细胞悬液加无血清培养基，各取500ul加入Transwell小室内，下层加含20%胎牛血清并含0.1%牛血清白蛋白培养基500ul在24孔板内，然后加入不同

16、浓度的开口箭和对照的生理盐水，37, 5%CO2温箱内培养4小时,将滤膜用甲醇固定, 常规HE染色封片, 在光学显微镜下选择滤膜随机选5个不同视野, 计数每个视野侵袭细胞数，计算平均值和细胞侵袭抑制率，实验重复4 次。 14 实验的原理由于上层是无血清培养基，下层是含20%胎牛血清并含0.1%牛血清白蛋白培养基，因为营养梯度加上B16-BL6黑色素瘤的高浸袭及转移能力，同时由于Transwell小室内的h-FN和MG的趋化作用，B16-BL6黑色素瘤会穿过人工基底膜胶到达人工基底膜的下层并贴壁。加入不同的药物与对照组进行对比，来观测药物的抑制B16-BL6黑色素瘤转移的作用。 1. 5 实验给

17、药的剂量 实验分四组，每组5个，分为高剂量组加0.6%的开口箭100ul（A） 中剂量组0.2%的开口箭100ul（B）低剂量组为0.1%的开口箭100ul（C） 0.9%生理盐水100ul（D） 1. 6 实验评价指标 光学显微镜下选择滤膜上下左右中5 个不同视野,计数每个视野侵袭细胞数,计算平均值，通过公式IR（%）=（1实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数）100%计算药物对细胞侵袭的抑制率。2 实验结果 如表3所示, B组B16-BL6 细胞侵袭重组基底膜有抑制作用，抑制率为21.46。表3 开口箭对B16-BL6 细胞侵袭重组基底膜的影响数 量细 胞 数抑制率（%）50.6mg

18、49.84.3459%0.2mg41.04.72146%0.1mg47.54.8901%0.9mg52.26.6与对照组（D组比较）P0.05, 有显著性差异性 讨 论肿瘤是威胁人类健康的大敌之一, 抗肿瘤的研究一直是医学研究的热点, 目前治疗肿瘤仍采用手术、放疗及化疗等方法。中药的抗肿瘤作用也日益引起关注,应用中药进行综合调节治疗也是近年研究的热点, 中药及其复方在抑制、杀伤肿瘤细胞,改善症状与体征, 以及减轻放化疗不良反应方面,都发挥着重要作用。中药抗肿瘤作用通过很多途径如中药及其复方可以通过诱导细胞因子产生、抑制酪氨酸激酶的活性和抑制突变等多种分子机制发挥抗肿瘤效应。Assinewe等

19、1 研究发现, 从人参根部提取的多糖,能明显刺激肺巨噬细胞分泌TNF, 从而通过直接杀伤肿瘤细胞、阻断肿瘤组织血供、激活机体免疫系统等途径发挥抗肿瘤作用。Ikken等2通过Ames试验证明,猕猴桃乙醇提取物可阻断强致癌物N2亚硝基化合物（NOC）的合成,对亚硝基二甲胺（HDMA） 、亚硝基二丁胺（NPYR ） 、亚硝基吡咯烷（NDBA ） 、亚硝基哌啶（NP IP）均有阻断作用, 其中对NDBA的阻断率可达51% , 提示猕猴桃对NOC所致的突变性有明显的抑制作用。有报道开口箭提取物有抗肿瘤作用，开口箭属植物所含化学成分多为甾体皂甙类化合物，均含有甾体皂甙和甾体皂甙元3，并有研究证实开口箭属植

20、物皂甙类化合物有细胞毒活性 4-6。皂甙是许多中药的有效成分，如人参皂甙有抗肿瘤作用人参皂甙Rg3简称（Rg3）是从红参中微量提取的人参皂甙的一种化学成分, 研究表明, Rg3对血行转移的肿瘤细胞的增殖、浸润及转移等具有抑制作用 7-12。同时皂甙还有许多其他药理作用如在学习和记忆的改善作用与抗衰老的有一定的作用13，有抗肝毒性14 。对糖尿病有治疗作用15。 侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征，是导致癌症患者临床死亡的主要原因。B16-BL6 小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6 细胞移植于动物局部, 瘤体增殖生长后, 侵袭周围正常组织和血管, 进入血循环, 到达

21、远处部位发生肿瘤转移。此模型可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵袭的完整转移过程16。本实验在体实验表明, 与对照组相比, 开口箭高、中，低剂量组肺转移率都有所降低。开口箭低剂量组小鼠与对照组相比结节明显减小, 肺转移程度减轻（P 0.05）, 表明开口箭能够在一定程度上抑制黑色素瘤的转移。体外实验表明, 对B16-BL6 细胞侵袭重组基底膜能力有一定的抑制作用。 开口箭的抗肿瘤作用机制有待进一步的研究。天然产物研究与利用湖北省重点实验室三峡大学化学与生命科学学院李青, 邹坤等证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元, 且含量较高 16 ，开口箭的抗肿瘤作用与其药效成分总皂苷有关。而皂苷的抗肿瘤作用机制已经有一些报道。如皂苷有促进肿瘤细胞的凋亡的作用。富力、鲁岐在细胞增殖动力学研究中观察到20 （R） 2人参皂甙Rg3促进肿瘤细胞凋亡而产生凋亡峰。大量抗癌药物是通过诱导细胞凋亡发挥其细胞毒作用。所以, 细胞凋亡是临床上体现对肿瘤实施化疗和放疗效果的一个重要标志, 陈俊霞等 17通过人参皂甙Rg3诱导膀胱癌细胞系EJ的凋亡作用的研究发现Rg3可通过诱导EJ细胞凋亡而发挥其抑制细胞增殖的作用。姜淑华等 18 采用