实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项文档格式.docx
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以氨苄青霉素为例：
1．准备足够量的1.5ml的EP管、两个100ml的离心管、0.22μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2.洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100ml的离心管中。
动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5ml的EP管中，每管0.5ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度
名称
储存浓度
工作浓度
氨苄青霉素〔ampicillin〕
100mg/ml
50μg/ml～100μg/ml
卡那霉素〔kanamycin〕
10mg/ml
10μg/ml～50μg/ml
氯霉素〔chloramphenicol〕
25mg/ml
μg/ml～25μg/ml
链霉素〔streptomycin〕
50mg/ml
四环素〔tetracyyline〕
IPTG
1M
-0.6mM
三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制
分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。
四、总DNA的提取
具体步骤参考试剂盒说明书。
革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。
五、基因扩增
1．引物与合成：
设计引物序列，发至生工公司进行合成〔jinan@sangon〕。
2．引物配制：
合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM，分装至无菌EP管中，做好标记〔一定要标记浓度！
〕后，于-20度保存备用。
3．PCR反应体系配制：
将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。
反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100μl反应体系为：
10×
buffer10µ
l，dNTP（10mM）2µ
l,引物各2µ
l〔10-50μM〕，模板1µ
l〔根据浓度加减体积〕，Taq酶1µ
l，ddH2O82µ
l〔注意：
加入顺序为：
水，buffer，dNTP，引物，模板，酶〕。
涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。
假设反应时间较长在反应混合液的上层加10-20µ
l的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。
4．将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数，例如：
94℃5min，94℃40sec，Tm55℃1min，72℃2min，72℃10min，16℃1h,一般设30个循环。
待温度降至16℃后停止PCR仪，尽快取出样品，不允许过夜。
六、琼脂糖核酸电泳
1.电泳缓冲液的配制：
电泳缓冲液一般为TAE〔或TBE〕,其配制方法参见表2，先配制50×
母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。
2.将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；
3.根据欲别离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶〔表3〕：
准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；
4．放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化（一般沸三次即好）,冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；
a）室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
b）向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
c）在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液〔1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚蓝〕，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
5．接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。
根据胶的长度设定电压，一般5-8V/cm，电泳20-40min,溴酚蓝跑完胶板的3/4左右即可；
6．电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中，室温下染色5-10min。
7．蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
如果要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，防止污染以及紫外灯引起DNA突变。
溴化乙锭〔EB〕有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。
但是要防止污染染色池和切胶板以外的区域。
操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。
表2.电泳缓冲液TAE配方
电泳缓冲液配方
缓冲液
使用液
浓贮存液〔每升〕
Tris-乙酸〔TAE〕
×
：
2mol/LTris-乙酸
50×
242gTris碱
05mol/LEDTA
ml冰乙酸
100mol/LEDTA
（pH8.0）
表3.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA的最正确分辨范围〔bp〕
0.5%
1,000～30,000
0.7%
800～12,000
1.0%
500～10,000
1.2%
400～7,000
1.5%
200～3,000
2.0%
50～2,000
七、回收与连接
1.将切下的目的条带按照回收试剂盒说明书进行产物回收；
2.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
稀释好的T载体浓度为12.5ng/μl，不用再确定浓度，每次用量为1μl。
3.连接反应体系的配制
〔1〕用SolutionI连接时，取一只分装的SolutionI离心管〔含5μlSolutionI〕，加入待连接的两个DNA样品：
载体与片段〔载体与片段的mol比为1：
3-5〕，加水补足10μl。
〔2〕用T4连接酶5μl连接时，取一只灭菌PCR管，加入10×
连接buffer1μl，待连接的两个DNA样品：
3-5〕，T4连接酶1μl，加水补足10μl。
〔3〕连接至T载体时反应体系一般为：
回收的PCR产物4μl,solutionI5μl，4倍稀释的pMD-18T克隆载体（12.5ng/μl〕1μl。
水，buffer，DNA样品，酶
4.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
5.将离心管置于16℃孵育4h以上或过夜。
八、E.coliDH5α和Bl21感受态细胞的制备
采用CaCl2制备法制备E.coliDH5α感受态细胞，步骤如下：
1．准备实验：
〔1〕准备LB固体培养基和分装于试管〔2-5ml〕和三角瓶〔100ml〕的液体培养基。
〔2〕分别配制含15%甘油的和不含甘油的0.1MCaCl2。
〔3〕准备干净培养皿、非常干净的100ml离心管2只，1.5mlEP管50只，1ml和200μl枪尖各一盒。
〔4〕将以上培养基和物品高压灭菌。
2．在LB平板上活化iDH5α。
将活化的iDH5α单菌落接种于成含LB培养基的试管中，37℃摇床过夜培养。
3．第二天按1%接种量接种到含100mlLB培养基的三角瓶中，37℃摇床培养至OD600=0.4-0.6〔约2h〕。
4．冰浴10min，倒入灭过菌的100ml离心管中离心，4000rpm，10min，4℃。
5．去掉上清，加20ml配制好的已灭菌的0.1MCaCl2，将菌体打散后静置20min，4000rpm离心10min，去掉上清。
6．加1-2ml灭菌的0.1MCaCl2（含15%甘油）制成感受态细胞。
将制好的感受态细胞分装成50μl小份保存于-80℃冰箱。
7．E.coliBl21和BL21（DE3）的制备方法同上。
〔1〕所有操作均在冰上进行；
〔2〕整个制备过程必须保证无菌操作；
〔3〕E.coliBl21，BL21（DE3），DH5α菌种每学期更换一次。
九、转化
1.取50μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入10μl连接产物或3-5μl纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴20min。
3.放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10min。
4.加入ml不含抗生素的LB液体培养基，于37℃培养1h。
5.将培养物4000rpm离心3min，保留约200μl上清于管中，将菌体用无菌枪尖轻轻打散，均匀涂布于含100μg/mlAmp+的平板外表，平板于37℃先正置1-2h，后倒置培养12-16h至菌落出现。
十、重组子的筛选和鉴定
从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+〔100μg/ml〕的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。
菌液可以用以下三种方法验证是否是阳性转化子。
同时培养阴性菌落作为对照！
〔一〕酚抽验证
取1ml菌液12,000rpm离心1min收集菌体，尽量倒干净上清后加入50μlTris饱和酚和50μl水，漩涡震荡5min充分混匀。
12,000rpm离心10min后迅速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
〔二〕质粒酶切验证
1.按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段的质粒作为阴性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳后可根据质粒的大小初步判断质粒中是否有插入片段，并推测质粒的浓度。
2.利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点，对质粒进行酶切。
根据待切质粒的浓度确定要加的体积,选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
3.在离心管中加入如下成分：
Buffer2μl
待切样品xμl〔一般为5μl左右〕
酶1μl10U/ul
加灭菌水补足20μl
酶的多少并不是一成不变的，关键要看待切DNA的浓度，如果浓度较低，可以适当少加酶。
不要在20μl体系中加入超过2μl的酶，那样容易产生星号活性。
4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
5、将离心管置于37℃中温育2h，假设待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。
最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。
如果50μl体系加入1μl酶，则可过夜酶切一般不会出现星号活性。
6、用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当扩大反应体积。
不同内切酶最适酶活温度不同，如BamHI最适酶活温度为30℃。
双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。
〔三〕菌落PCR
挑取培养皿上的部分菌落或取μl菌液作为模板进行PCR扩增，每管反应体系最低可少至10μl，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
假设为阳性转化子，可检测到插入的目的条带。
将鉴定好的阳性转化子菌液500μl送上海博尚生物技术进行序列测定。
冬天温度很低时需做成甘油管样品送测！
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