++1011生物工程下游技术每章课后提示归纳+猫纸升级版Word文档格式.docx

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2、何谓双水相萃取?

常见的双水相构成体系有哪些？

3、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理

第六章沉淀和膜分离技术

1.什么是沉淀法？

2.沉淀法纯化蛋白质的优点、缺点有哪些？

3.常用的沉淀方法包括哪些？

4.有机溶剂沉淀法的原理是什么？

5.影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？

6.何谓盐析？

其原理是什么？

7.何谓“Ks”分级盐析法？

何谓“β”分级盐析法？

8.常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？

9.高聚物沉淀的原理是什么？

常用的高聚物是什么？

10.等电点沉析的工作原理是什么？

11.什么是膜分离技术？

12.膜分离技术的原理及特点是什么？

13.膜有哪些分类？

14.微滤、超滤、纳滤、反渗透的相同点和相异点？

15.膜材料有哪些要求？

都有哪些类别？

16.膜组件有哪些种类？

17.微滤膜的主要性能特点是什么？

过滤的机理有哪些？

18.微滤膜的污染原因、预防措施、清洗措施分别有哪些？

生物技术：

是有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。

生物分离：

生物工程中生物产品如生化制品、蛋白质、多核苷酸和细胞等的分离和纯化。

生物技术的重要组成部分。

分离因子：

目标产物纯化程度用分离因子a表达，又称分离系数，是目标产物和杂质在两相中的分配系数的比值，分离因子越大，分离效率越高。

细胞破碎：

利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术

沉淀分离：

改变溶液条件，使溶解在溶液中的目的物以固体形式分离出的操作技术。

利用不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的

盐析：

蛋白质在高离子强度的中性盐溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象

有机溶剂沉淀：

在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

等电点沉淀法：

调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。

通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用

泡沫分离：

依据表面吸附原理，以通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体，利用组分的表面活性差，对液相中的溶质或颗粒进行分离

过滤：

是将料液通过固体支持或者过滤介质时，使得固体物质从溶液中分离。

膜分离：

利用膜的选择性，以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

萃取：

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法

反萃取:

调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相

乳化现象:

即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。

物理萃取：

溶质根据相似相溶原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。

化学萃取：

利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。

萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。

超临界流体：

当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。

吸附（adsorption）：

溶质从液相或气相转移到固相的现象。

离子交换容量：

单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。

色谱：

是根据混合物中的溶质在两相之间分配行为的差别引起的随流动相移动速度不同进行分离的方法。

分离度：

两个洗脱位置相邻的溶质的分离的程度。

凝胶过滤色谱：

利用凝胶为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。

离子交换色谱：

利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。

疏水相互作用色谱HIC：

利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行的蛋白质类大分子分离纯化的洗脱色谱法。

反相色谱：

利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。

羟基磷灰石色谱：

利用HAP的片状晶体颗粒为固定相分离纯化蛋白质的液相色谱技术。

生物亲和作用（bioaffinity）:

生物分子间的特异性相互作用或简称亲和作用（affinity）。

亲和色谱：

利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。

电泳：

荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。

电泳分离：

利用荷电溶质在电场中泳动速度的差异进行的分离方法。

凝胶电泳：

是区带电泳分离方法，主要利用凝胶的分子筛选作用使分子大小不同的电解质得到分离。

包含体：

蛋白质多肽链在细胞内发生错误折叠和聚集，形成的没有生物活性的聚集体。

特点：

一级结构正确，立体结构错误，没有活性

蛋白质复性：

对于以包含体形式表达的蛋白质，需要在分离回收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。

又称为蛋白质的体外再折叠.

流加复性方法：

将变性蛋白质分多批次加入到复性液中，或采用连续流加到复性液中

辅助因子：

在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体的生成。

又称“稀释添加”复性

分子伴侣：

是一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分。

人工分子伴侣：

人工开发的，模拟天然分子伴侣辅助作用的复性系统。

结晶：

是从液相或气相生成形状一定，分子有规律排列的晶体的现象。

饱和溶液：

当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；

过饱和溶液：

溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

介/亚稳状态：

一定饱和度范围内维持无结晶析出的状态。

干燥：

是利用热能去除目标产物的浓缩悬浮液或结晶产品中湿份的单元操作，通常是生物产品成品化前的最后下游加工过程。

传导干燥：

载热体不与湿物料直接接触，而是通过导热介质以传导的方式传给湿物料。

间接加热干燥。

对流干燥：

载热体以对流方式与湿物料颗粒（或液滴）直接接触，向湿物料对流传热。

又称直接加热干燥。

载热体同时又是载湿体。

湿度：

湿空气中的水汽含量。

饱和湿度：

若空气中的水汽风压为同温度下的饱和蒸汽压Ps，则湿空气显饱和状态，测试的空气湿度称为饱和湿度。

绝对湿度：

湿空气中水汽的质量与湿空气中空气的质量之比，H。

可以用分压的形式表示。

相对湿度：

是水汽分压与饱和蒸汽压之比，φ。

Φ可直接反映空气的载湿能力。

干球湿度：

湿空气的真实温度

革兰氏阴\阳性菌的细胞壁结构：

磷脂，脂蛋白，肽聚糖;

肽聚糖

破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。

区带离心：

依据实际物系特点（目的物和其他组分性质和相互作用等）、分离目的和分离所需程度，调整离心力和时间，使得不同组分得以分离。

热沉淀：

根据蛋白质热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。

电渗析：

用分子电荷性质和分子大小的差异进行工作的膜分离方式。

膜的操作特性：

浓度极化：

膜表面附近浓度高于主体浓度的现象。

凝胶极化：

分离含有菌体，细胞或其他固形成分的料液时，膜表面形成凝胶层。

膜污染原因：

凝胶极化引起的凝胶层；

溶质在膜表面的吸附层；

膜孔堵塞；

膜孔内的溶质吸附；

膜的劣化：

化学，物理，生物

吸附类型

A物理吸附：

吸附剂和吸附物通过分子间力（范德华力）产生的吸附称为物理吸附。

这是一种最常见的吸附现象，其特点是吸附不仅限于一些活性中心，而是整个自由界面。

B、化学吸附：

化学吸取附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力范围，它与通常的化学反应不同的地方在于吸附剂表面的反应原子保留了它或它们原来的格子不变。

C，离子交换:

在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。

蛋白质为何能形成稳定溶液

（1）蛋白质分子周围也蛋白质紧密或疏松结合的水化层，使其形成稳定的胶体溶液。

（2）蛋白质分子间的静电排斥作用

化学和生物化学渗透方法：

（1）酸碱处理，改变ph值，可改变其电荷性质，使蛋白与蛋白之间相互作用力下降易于溶解。

如强碱提取核酸。

（2）化学试剂处理，如添加有机溶剂可增大细胞通透性，加盐酸胍可破环氢键作用。

（3）酶溶法，如溶酶菌作用于革兰氏阳性菌细胞壁，纤维素酶作用于植物细胞壁

目标产物的选择性释放原则：

⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围

当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结－融化法等。

当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法．

（2）选择性溶解目标产物

当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：

螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。

同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。

另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。

分离作用主要取决于组分在气－液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异。

生物亲和作用的本质

（1）生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。

（2）利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化

（3）亲和作用的分子（物质）对可以是：

大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。

（4）具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔”的空间结构关系。

（5）亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合：

静电作用氢键疏水相互作用

亲和作用色谱原理及过程

（1）配基固定化：

亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂

（2）吸附样品：

当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出

（3）样品解析：

然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来

包含体分离纯化的一般过程

（1）细胞破碎

（2）离心沉降回收包含体（3）包含体的洗涤（4）离心沉降回收包含体

简述凝胶排阻色谱（分子筛）的分离原理

答：

凝胶排阻色谱的分离介质（填料）具有均匀的网格结构，其分离原理是具有不同分子量的溶质分子，在流经柱床是，由于大分子难以进入凝胶内部，而从凝胶颗粒之间流出，保留时间短；

而小分子溶质可以进入凝胶内部，由于凝胶多孔结构的阻滞作用，流经体积变大，保留时间延长。

这样，分子量不同的溶质分子得以分离。

影响分离度的因素：

（1）增加塔板数，可以增加分离度，设法降低理论塔板高度H，是提高分离度的最好方法

（2）增大容量因子，可以提高分离率。

但会延长分离时间，一般在k是在2—7（3）分离率a选择性增大

凝胶色谱的操作方法

1凝胶的选择与处理2装柱3凝胶柱的平衡4加样5洗脱6收集各洗脱峰

何谓亲和吸附，有何特点？

亲和吸附是吸附单元操作的一种，它是利用亲和吸附剂与目标物之间的特殊的化学作用实现的高效分离手段。

亲和吸附剂的组成包括：

惰性载体、手臂链、特异性亲和配基。

亲和吸附的特点是高效、简便、适用范围广、分离速度快、条件温和，但载体制备难度大，通用性差，成本较高。

简述结晶过程中晶体形成的条件

结晶过程包括过饱和溶液的形成、晶核的形成及晶体的生长三个过程，其中溶液达到过饱和状态是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。

据，常用于测定未知蛋白质的亚基分子量。

电泳的简单原理

（1）蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。

（2）带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。

聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应

（1）在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。

（2）凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状

（3）凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力，这种现象被称为分子筛效应

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE的异同

相同点：

两种都是以聚丙烯酰胺为介质电泳方式。

不同点：

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是依据其电荷、分子形状和分子大小（分子量）差异实现分离的；

SDS-PAGE由于加入了SDS和强还原剂（DTT等），破坏了蛋白质分子的高级（二级、三级、四级）结构，并与蛋白质形成荷大量负电荷的聚合物，消除了不同蛋白质分子电荷及分子形状差异，而仅将分子量差异作为分离依据，常用于测定未知蛋白质的亚基分子量。

为什么不饱和湿空气的湿球温度小于干球温度？

在湿空气中用普通问温度计测得的温度是湿空气的真实温度，称干球温度。

若用湿纱布包裹普通酒精温度计的感温球，即制成湿球温度计。

当湿气温度高速度通过湿纱布表面时，如果空气中的相对湿度少于100﹪，由于湿布中水分蒸发需要散热，使水温下降，水温下降使到湿空气与纱布之间产生温差，向湿纱布传热，当温度下降到一定程度时，传热速率与蒸发的传热速率相等，达到平衡状态，温度不再下降。

此时，不饱和湿空气的湿球温度小于干球温度，空气的相对湿度小，即空气越干燥，湿球温度越低。

生物分离的流程

原料液→细胞分离→清液-胞外产物→[细胞-胞内产物→细胞破碎→碎片分离→（包含体→溶解→复性）]→粗分离→纯化→脱盐→浓缩→成品化

泡沫分离原理：

泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性（如表面活性剂）或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起（如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等），在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集，藉气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。

生物分离技术的特点：

（为什么价格高）

①产物浓度低的水溶液

（原因：

a氧传递限制；

b细胞量;

c产物抑制）

②组分复杂

a大分子;

b小分子;

c可溶物;

d不可溶物;

e化学添加物

大分子物质：

核酸、蛋白质、多糖、类脂等

小分子物质：

代谢产物，如氨基酸、有机酸、生物碱、可溶性与不可溶物质

③产物稳定性差

产物失活

a.化学降解（pH,温度）;

b.微生物降解（酶作用，染菌）

④质量要求高（药品或食品）：

安全性：

除去热原

纯度：

蛋白类药物中杂蛋白<

2%，胰岛素中<

0.01%

⑤分批操作，生物变异性大

绘制结晶过程中饱和曲线和过饱和曲线图，并简述其意义

结晶过程中的饱和温度曲线和不饱和温度曲线的简图如右图所示：

S-S曲线为饱和温度曲线，在其下方为稳定区，在该区域溶液为不饱和溶液，不会自发结晶；

T-T曲线为过饱和温度曲线，在其上方为不稳定区，能够自发形成结晶；

S-S曲线和T-T曲线之间为亚稳定区，在该区域，溶液为过饱和溶液，但若无晶种存在，也不能自发形成晶体