辽宁科技攻关计划项目辽宁海洋与渔业网Word文档格式.docx

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（1）滕炜鸣,李文姬,张明,等.虾夷扇贝脓胞病病原的分离、鉴定与致病性[J].水产学报,2012,36（6）:

937-943.

（2）RuiLiu,LimeiQiu,ZuoanYu,etal.IdentificationandcharacterisationofpathogenicVibriosplendidusfromYseeoscallop（Patinopectenyessoensis）cultruedinalowtemperatureenvironment[J].JournalofInvertebratePathology,2013,114:

144-150

（3）虾夷扇贝闭壳肌出现脓胞可能不是大规模死亡的唯一症状

连续多年流行病学调查发现，闭壳肌出现脓胞是筏养二龄虾夷扇贝大规模死亡的典型发病症状，得到学者一致认可。

然而申请人通过海区调查和室内模拟实验表明，外套膜颜色发黄和贝壳内侧出现褐色沉积可能也是虾夷扇贝大规模死亡的典型症状。

贝壳内侧出现褐色沉积有学者认为可能是扇贝互相碰撞导致外套膜受损，在恢复过程中分泌的物质。

因此多年来对此症状一直没有进行研究。

2016年海区调查和室内模拟实验过程中，申请人发现实验中所有死亡扇贝内壳均有褐色沉积，存活下来但状态不好的扇贝在贝壳内侧也存在褐色沉积；

而根据海区调查结果，外套膜发黄的扇贝在海区死亡率很高。

因此，外套膜发黄且贝壳内侧有褐色沉积很可能不是由于机械损伤导致，而是由于病原感染产生的典型症状，和虾夷扇贝大规模死亡相关性很大，有必要对其产生原因及可能致病病原进行相关研究，国内外对此也很少有相关研究。

二、与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析；

海洋贝类病害研究最早见于1919年，Danglade在牡蛎体内发现一种寄生性蠕虫（3）。

20世纪40年代，墨西哥湾养殖区的牡蛎大规模死亡，其后蔓延到整个东部沿海地区，通过对牡蛎进行病理学分析，研究者认为引起牡蛎大规模死亡的原因是一种派金虫（perkinsusmarnius）的海洋鞭孢簇虫，促使美国、法国等相继开展了广泛的海洋贝类病害学研究（4）。

1987年法国首次报道了蛤弧菌（Vibriotapetis）,它引起养殖的菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）亲贝发生大规模死亡。

值得注意的是该病主要特征就是外套膜和贝壳边缘之间沉积几层褐色的环状物（5）。

这和虾夷扇贝大规模死亡的症状有些相似。

1991年，在北美地区养殖的太平洋牡蛎（Crassostreagigas）夏季发生大规模死亡，主要症状是外套膜有病灶性棕色病变区域或部分组织有绿黄色结节，这和虾夷扇贝外套膜的褐色沉积也比较类似，而粗形诺卡氏菌（Nocardiacrassostreae）经鉴定是其致病菌。

（6）项目组在虾夷扇贝闭壳肌脓胞中分离出的致病病原查氏弧菌，首次发现是在希腊养殖的轮虫体内，它和灿烂弧菌在分类地位上非常相近（7）。

我国贝类病害研究相对较晚，但近年来，随着我国海洋贝类养殖规模的迅速发展，养殖贝类大规模死亡问题日益严重（8）。

20世纪90年代，栉孔扇贝（chlamysfarreri）暴发过大规模死亡，宋微波（9）、王崇明（10）等认为一种球形病毒粒子为导致栉孔扇贝大规模死亡的直接原因；

海湾扇贝（Argopectenirradians）、贻贝（Mytilusgalloprovin-cialis）和杂色鲍（H.diversicolor）等都曾暴发过大规模病害，弧菌、球形病毒等是其感染病原（11）。

进入21世纪，河北秦皇岛海域暴发大规模褐潮，导致海湾扇贝稚贝滞长，甚至发生死亡。

南方的鲍也因为高密度养殖发生大规模病害。

我省虾夷扇贝自2007年以来也发生了大规模死亡现象，多年来申请人所在团队一直对此进行长期研究，并取得一定进展，我们在虾夷扇贝脓胞中首次分离出可能的致病菌查氏弧菌，同时在体内发现了病毒粒子并进行了病原学相关研究和流行病学调查（12）;

分析了水温、饥饿和病害对虾夷扇贝大规模死亡的影响（13）;

探讨了长海县海水环境和养殖模式与虾夷扇贝大规模死亡的关系，调查虾夷扇贝浮筏养殖海区中浮游病毒丰度（14），对浮筏养殖海区表层沉积物和虾夷扇贝大规模死亡的关系进行了初步分析（15），通过不同养殖密度组的设置初步证明养殖密度和扇贝大规模死亡的相关性（16）。

在现有工作基础上，对虾夷扇贝大规模死亡致病病原进行分离鉴定并建立快速检测技术，是后续科研工作的基础，也是对我省筏养虾夷扇贝产业一个科学交待。

（3）Danglade,E.TheflatwormasanenemyofFloridaoysters[J],Govt.print,1919.

（4）Crage,A,Powell,E,Fay,R,etal.DistributionofPerkinsusmarinusinGulfCoastoysterpopulations.EstuariesandCoasts[J],1989,12

（2）:

82-91

（5）Paillard,C,Maes,P,Oubella,R.Brownringdiseaseinclams[J].AnnualReviewofFishDisease,1994,4:

219-240

（6）Friedman,C,Beaman,B,Chun,J,etal.NocardiaCrassostreaespnov.,thecausalagentofnocardiosisinPacificoysters[J].InternationalofJournalofSystematicBacteriology.1998,48:

237-246

（7）F.L.Thompson,C.C.Thompson,Y.Li,etal.Vibriokanaloaesp.nov.,Vibriopomeroyisp.nov.andvrbriochagasiisp.nov.,fromseawaterandmarineanimals[J],InternationaljournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2003.53:

753-759

（8）吴信忠,潘金培,江静波.热带海洋珍珠贝类立克次体（RLO）并研究V11大珠母贝育苗期幼虫群体RLO病流行病学研究[J].海洋学报,2003,25

（2）:

93-98

（9）宋微波,王崇明,王秀华,等.栉孔扇贝大规模死亡的病原研究新进展[J].海洋学,2001,25（12）:

23-26.

（10）王崇明,王秀华,艾海新,等.栉孔扇贝大规模死亡致病病原的研究[J].水产学报,2004,28（5）:

547-553.

（11）张国范,李霞.我国养殖贝类大规模死亡的原因分析及防治对策[J].中国水产,1999,9:

34-39

（12）于佐安,李文姬,张明,等.虾夷扇贝大规模死亡的流行病学研究及可能致病因子的探讨[J].中国海洋大学学报,2013,43（6）:

052-057.

（13）于佐安,李大成,王笑月,等.水温、饥饿和病害对长海县筏养虾夷扇贝大规模死亡影响的初步研究（文章待发）

（14）于佐安,李文姬,张明,等.大连市长海县虾夷扇贝养殖海区浮游病毒丰度的研究[J].水产学报,2011,35（6）：

911-917

（15）于佐安,王笑月,李大成,等.长海县筏养区表层沉积物与虾夷扇贝大规模死亡相关性分析[J].河北渔业,2016,12:

17-23

（16）于佐安,谭克非,张明,等.筏式虾夷扇贝养成期不同密度生长与经济效益分析[J].水产学报,2016,40（10）:

1624-1633

三、主要攻关内容及技术路线（技术可行性分析）；

（一）主要攻关内容

1虾夷扇贝脓胞病病原分离鉴定

在扇贝大规模死亡高峰期，从虾夷扇贝闭壳肌脓胞中分离可疑致病病原，进行回归感染，确定具有致病性的病原，通过细菌常规鉴定和16srRNA基因序列测定及系统发育学分析，鉴定其分类地位。

根据柯氏法则，结合流行病学调查结果，确定导致虾夷扇贝闭壳肌出现脓胞的致病病原。

2虾夷扇贝“褐色沉积病”病症形成机制研究

根据虾夷扇贝外套膜边缘发黄，贝壳内侧有褐色沉积这一症状，暂将该症状命名为“褐色沉积病”。

分析褐色沉积物的结构和物质组成；

揭示病变外套膜组织病理学、细胞病理学变化和褐色沉积之间的联系；

确定病症产生原因是物理损伤还是致病病原。

对导致虾夷扇贝“褐色沉积病”的致病病原进行鉴定。

探讨虾夷扇贝脓胞病、虾夷扇贝“褐色沉积病”和虾夷扇贝大规模死亡之间的关系。

3致病病原全基因组测序及快速检测技术的建立

进行全基因组测序，对序列进行比对分析，找到保守特异的区域，设计特异性引物，建立PCR检测技术。

（二）技术可行性分析

1、虾夷扇贝脓胞病病原分离鉴定

（1）样品收集

在发病高峰期6月份-7月份，采集虾夷扇贝样品，低温运回实验室，解剖观察闭壳肌有无脓胞，收集脓胞及闭壳肌边缘组织接种于培养基上。

（2）培养基选择

面对未知病原，培养基应同时选择几种通用培养基和选择性培养基。

本研究中选择海洋盐琼脂培养基（MSA-B）、海洋琼脂2216培养基（MA2216）、TCBS霍乱弧菌培养基（TCBS）和胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）。

（3）接种培养

将带有病原的组织接种于四种培养基后，统计菌落形态和数量，根据细菌分离中“优势理论”，将四种培养基中均表现为优势生长的细菌或某个培养基中表现为优势生长的细菌鉴定为可疑致病病原。

将可疑致病病原菌菌落挑取在新培养基上进行纯培养。

（4）回归感染

在适宜水温条件下，选择健康有活力的虾夷扇贝，将一种或几种可疑致病菌扩大培养进行浸浴感染实验，根据“科赫法则”确定可疑病原菌是否为致病病原。

（5）细菌鉴定

对致病病原菌的细菌形态特征、培养特征和生理生化特性等进行研究。

同时通过16srDNA测序进行分子鉴定。

2、虾夷扇贝“褐色沉积病”发生机制研究

（1）样品采集和处理

发病高峰期5月-8月期间，采集虾夷扇贝样品低温运回实验室。

取发黄外套膜组织和健康外套膜组织用组织固定液、电镜固定液分别固定，从贝壳内侧收集褐色沉积物质。

同时取发黄外套膜组织接种培养基上。

（2）组织切片和超薄电镜切片观察

通过健康外套膜组织和发黄外套膜组织切片观察确定外套膜边缘发黄的原因。

通过超薄电镜切片观察外套膜病灶处是否存在病毒粒子或细菌及其他微生物。

（3）褐色沉积物质结构分析

利用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱分析以及X射线衍射分析等方法对褐色沉积物质的微结构进行分析，通过和贝壳结构对比，结合组织切片和超薄电镜切片观察结果，分析褐色沉积物质和外套膜之间的关联。

（4）外套膜受损模拟实验

取外套膜正常、健康有活力的虾夷扇贝，利用贝壳、镊子或剪刀等工具使外套膜组织部分受损，在适当水温条件下进行模拟养殖实验，判断外套膜受损是否是外套膜发黄和贝壳内侧产生褐色沉积的主要原因。

（5）病原分离鉴定

若证明外套膜受损并不是“褐色沉积病”主要原因，则采取第一部分实验方案分离鉴定虾夷扇贝“褐色沉积病”致病病原。

（6）回归感染实验

将虾夷扇贝脓胞病致病病原和虾夷扇贝“褐色沉积病”致病病原共同感染健康虾夷扇贝，观察发病症状，统计死亡率。

结合各自病症病原回归感染实验结果，依据“科赫法则”判断虾夷扇贝大规模死亡的致病病原，分析脓胞病和“褐色沉积病”与大规模死亡之间的关系。

（1）全基因组测序

提取致病病原总DNA,构建16sRNA文库，进行全基因组测序，并进行数据拼接。

（2）特异性引物设计

对全基因组进行数据拼接后，分析序列找到保守区，通过NCBI进行BLAST比对，设计特异性引物。

（3）检测技术的建立

通过对PCR模板浓度、反应条件和特异性等反应条件的摸索，建立PCR快速检测技术。

或者进一步优化建立荧光实时定量PCR检测技术。

4技术路线图

主要症状

致病病原研究

四、现有工作基础和条件；

1工作基础

长海县筏养虾夷扇贝开始大规模死亡以来，项目申请人依托海洋公益性科研专项“虾夷扇贝资源利用技术研究”，开展了虾夷扇贝大规模死亡流行病学调查，明确了虾夷扇贝死亡规律，并在扇贝体内发现病毒粒子，通过病原学、组织病理学和回归感染等研究手段证明病毒粒子可能并不是导致虾夷扇贝大规模死亡的致病病原，水温可能和扇贝死亡密切相关[12]。

申请人所在团队从虾夷扇贝闭壳肌脓胞中首次分离出查氏弧菌[1]，同时和中科院海洋所团队合作从虾夷扇贝闭壳肌脓胞中分离出灿烂弧菌[2]。

两种病原菌在分类地位上比较相近，缺乏进一步研究，但也为虾夷扇贝闭壳肌脓胞病的致病病原的准确鉴定奠定了良好的工作基础。

申请人不仅参与了已报道的虾夷扇贝闭壳肌脓胞病病原菌分离鉴定工作，还在虾夷扇贝流行病学、养殖技术、海区环境等和扇贝死亡有关的方面都作了大量研究工作，这都为本项目的成功实施打下了很好的基础。

针对虾夷扇贝大规模死亡致病病原研究同时，申请人结合流行病学调查结果，开展了不同水温、不同饵料浓度的室内模拟实验，证明病害是导致虾夷扇贝大规模死亡的主要直接原因之一，而水温和饵料缺乏也和虾夷扇贝大规模死亡有一定联系。

同时发现虾夷扇贝外套膜边缘发黄、贝壳内有褐色沉积的症状在死亡虾夷扇贝体内普遍存在，分析该症状形成机制，并探讨该症状和虾夷扇贝大规模死亡之间的因果关系十分必要。

2工作条件

申请人所在单位辽宁省海洋水产科学研究院隶属于辽宁省海洋与渔业厅，是省级重点科研机构。

主要从事海洋与渔业科技方面的基础性、应用性和公益性研究。

研究院现有在职人员141人，其中科技人员120人，占在职职工总数的85.1%。

科技人员中具有高级职称人员31人，具有博士学位12人、硕士学位45人。

成立五十余年来，该院研究获得了包括国家自然科学奖、国家科技进步奖等在内的一大批具有较高科技含量和实用价值的重大科研成果，海水增养殖学、海洋经济动植物增养殖生态学、应用遗传学、渔业病害学、渔业资源学、渔业环境保护学、分子生物学等是该院的优势学科，其整体科研实力和水平在全国同类科研院所中处于领先地位。

目前我省沿海虾夷扇贝的增养殖产业，也是在我院首先从日本引进并推广形成的，《虾夷扇贝引种及规模化增养殖技术研究》成果获2004年度国家科技进步二等奖、2003年度获辽宁省科技进步一等奖，这些都为该项目的实施提供了良好的平台。

依托研究院建设有“辽宁省应用海洋生物技术开放实验室”和“辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室”，实验室装备有先进的科研仪器设备100多台（套），为海洋环境监测、海水养殖良种培育和养殖生物病原检测等提供了科研仪器设备的保障。

另外，研究院还具有完善的动物活体实验室和引育种中心，试验水体达6000m3，为本项研究的完成提供了试验场地的保证。

五、申请人基础条件（包括主要研究成果）；

项目主要承担人员于佐安，男，1981年11月出生，硕士，助理研究员，毕业于中国海洋大学水产学院水生生物学专业，现在辽宁省海洋水产科学研究院海水养殖室工作。

先后参与国家973项目“扇贝大规模死亡流行病学的研究”、山东省科技攻关项目“栉孔扇贝急性病毒性坏死症核酸诊断技术的研究”和国家８６３项目“浅海生态养殖扇贝流行病控制技术”。

国家海洋公益性行业科研专项“虾夷扇贝资源利用技术研究”（200805037）、辽宁省农业科技特派团项目“长海县虾夷扇贝高效健康养殖技术研究及示范”（2008203004）和国家贝类产业技术体系建设专项等多项国家、省市级的项目。

所参与研究项目均与栉孔扇贝和虾夷扇贝病害和健康增养殖有关。

以第一作者名义发表文章6篇，待发表文章1篇，其它作者名义发表文章12篇。

本课题组团队成员在虾夷扇贝研究方向具有多年积累，经验和科研实力都足以支持完成此项课题。

与此同时，本课题组团队成员也是以产业服务为目的的国家贝类产业技术体系综合试验站的主要团队成员，长年接触产业第一线，了解虾夷扇贝养殖生产中各种问题，深知当前产业发展迫切需要解决的问题。

这也为该课题的顺利实施提供良好的条件。

以第一作者名义发表文章和待发表文章：

①于佐安,王崇明,任伟成等.鱼虾贝病毒分离纯化技术概述.渔业科学进展，2009,30

（2）:

131-135

②于佐安,王崇明,任伟成等.栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒（AVNV）垂直传播途径的研究.水产学报，2009,11（6）：

1034-1039

③于佐安,李文姬,张明,等.虾夷扇贝大规模死亡的流行病学研究及可能致病因子的探讨[J].中国海洋大学学报,2013,43（6）:

④于佐安,李文姬,张明,等.大连市长海县虾夷扇贝养殖海区浮游病毒丰度的研究[J].水产学报,2011,35（6）：

⑤于佐安,王笑月,李大成,等.长海县筏养区表层沉积物与虾夷扇贝大规模死亡相关性分析[J].河北渔业,2016,12:

⑥于佐安,谭克非,张明,等.筏式虾夷扇贝养成期不同密度生长与经济效益分析[J].水产学报,2016,40（10）:

⑦于佐安,李大成,王笑月,等.水温、饥饿和病害对长海县筏养虾夷扇贝大规模死亡影响的初步研究（文章待发）

六、进度安排和实施方案（包括运行机制）；

1、2017年5月1日-2018年4月

虾夷扇贝脓胞病致病病原分离鉴定：

2017年6月-7月份采集发病虾夷扇贝；

将细菌接种于四种培养基上；

根据菌落形态和统计分析确定优势种；

纯培养可疑致病菌，进行回归感染实验，确定致病菌；

通过传统细菌分离鉴定方法和分子生物学鉴定方法对致病菌鉴定分类；

测定全基因组序列，找到保守区域进行比对，设计特异性引物，优化反应条件，建立PCR快速检测技术。

2、2018年5月-2018年7月

虾夷扇贝“褐色沉积病”症状形成机制

（1）：

2018年6月-8月份采集发病虾夷扇贝和健康虾夷扇贝，收集贝壳内侧褐色沉积；

组织固定和电镜固定发黄外套膜组织和健康外套膜组织；

匀浆发黄外套膜边缘组织，接种到四种培养基上，根据脓胞病病原分离的方法分离“褐色沉积病”可疑致病菌并进行纯培养；

3、2018年8月-2018年12月

虾夷扇贝“褐色沉积病”症状形成机制

（2）：

固定好的组织样品和电镜样品进行石蜡包埋切片和超薄电镜切片，观察二者之间组织结构和细胞结构变化，以及有无可疑病原微生物出现；

利用扫描电镜、红外光谱和x衍射等技术手段观察褐色沉积内部结构；

开展外套膜受损模拟实验，同时开展可疑致病菌回归感染实验，确定虾夷扇贝“褐色沉积病”是外套膜物理损伤导致还是病原菌导致。

将虾夷扇贝脓胞病致病病原和虾夷扇贝“褐色沉积病”致病病原共同感染健康虾夷扇贝，结合单个病症病原感染的实验结果，探讨两种病症和虾夷扇贝大规模死亡之间的关系。

4、2019年1月-2019年3月

测定虾夷扇贝“褐色沉积病”致病病原的全基因组序列，找到保守区域进行比对，设计特异性引物，优化反应条件，建立PCR快速检测技术。

5、2019年4月-项目截至期

准备项目结题相关材料

七、预期成果和考核目标；

1预期成果

（1）分离鉴定虾夷扇贝脓胞病和“褐色沉积病”致病病原菌

（2）探明虾夷扇贝“褐色沉积病”病症形成机制

（3）测定致病菌全基因组序列

（4）建立致病菌快速检测技术

2考核目标

（1）分离鉴定致病菌1株或1株以上

（2）建立1项或2项快速检测技术

（3）发表文章3篇-5篇

八、推广及应用前景；

1长海县筏养虾夷扇贝大规模死亡是困扰我省当前虾夷扇贝养殖产业可持续发展的重要原因，对当地经济发展和社会稳定都有一定影响。

项目研究成果将找到扇贝大规模死亡病害的主要致病病原，建立快速检测技术，为研究致病机理，探索致病病原在宿主体内感染规律和传播途径奠定研究基础，对病害预警预报体系建立和我省虾夷扇贝产业可持续发展具有重要的科学意义。

2长海县筏养虾夷扇贝目前养殖规模约15万台左右，连续多年虾夷扇贝大规模死亡造成地方政府每年经济损失约2亿元。

项目研究成果将为抗病家系选育、抗逆基因筛选等遗传育种领域提供技术支撑，抗病虾夷扇贝品种一旦选育成功，有望能够解决大规模死亡问题，对筏养虾夷扇贝产业的发展具有重要意义。

九、经费概算及来源；

1项目总研究经费10万元

项目资金来源

及经费用途

【提示】注明项目经费来源经费单位：

万元

合计

政府部门

自有

资金

银行

贷款

其他

国家

科技厅

市县

10

已投入资金

新增

【提示