香菇多糖的提取Word下载.docx
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香菇中又含酪酸氧化酶，有降低血压的功效。
香菇中还分离出降血清胆固醇的成分（C6H11O4N5,C9H11O3N5）
香菇多糖能提
香菇
高辅助性T细胞的活力而增强人体体液免疫功能。
1.3药作价值
香菇含有一种分子量为100万的抗肿瘤成分-----香菇多糖，含有降低血脂的成分-----香菇太生，香菇腺嘌呤和腺嘌呤的衍生物，香菇还含有抗病毒的成分------干扰素的诱发剂----双链核糖核酸，是不可多得的保健食品之一。
香菇中含不饱和脂肪酸甚高，还含有大量的可转变为维生素D的麦角甾醇和菌甾醇，对于增强抗疾病和预防感冒及治序有良好效果。
经常食用对预防人体，特别是婴儿
因缺乏维生素D而引起的血磷、血钙代谢障碍导致的佝偻病有益，可预防人体各种粘膜及皮肤炎病。
香菇多糖的主要的药理价值有:
免疫调节作用;
抗肿瘤作用;
抗病毒作用;
对寄生虫,霉菌,细菌等感染均有治疗作用;
有抗衰老,抗辐射作用,还具有预防实验性高脂血症和高血糖作用.在临床上LNT还用于治疗小儿反复呼吸道感染,糖尿病,寻常型银屑病,硬皮病,面部扁平,尖锐湿疹等.此外,硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV作用,香菇多糖在治疗胃癌,结肠癌,肺癌等方面有良好疗效.作为免疫辅助药物,香菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生,发展和转移,提高肿瘤对化疗药物的敏感性,改善患者的身体状况,延长其寿命.香菇多糖有如此神奇的生物活性,科学家们已经开始在基因水平探讨香菇多糖生物活性的机制.总之,香菇多糖具有广泛的药理作用,而且其疗效好,毒副作用小,是一种应用前景广阔药物。
1.4香菇多糖提取的现状分析
目前国内对香菇多糖的分离有了很大发展，主要采用的方法有传统热水提取法、酸提取法、碱提取法、这些方法都有其优点，也有其难以克服的不足之处。
传统热水浸提方法存在能耗高，提取时间长的缺点，其工业化应用和发展受到限制。
酸碱处理香菇，反应条件剧烈，提取液又需经过中和反应，很可能破坏多糖的结构，会使香菇多糖的分子量降低，致使药用价值下降。
微波辅助提取法具有设备简单，快速，高效，安全等特点：
可供选择的溶剂较多。
利用微波强化固液浸取过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术[3]。
近年来生物酶广泛应用于各个领域，在国内也开始将其应用于中草药提取中。
多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。
试验发现木瓜蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。
1.5香菇多糖提取的研究意义
多糖是近年来研究最为活跃的高分子化合物,真菌糖由于具有多种生物活性,其研究进展则尤为迅速。
目前,从各类生物材料中提取的具有生物活性的多糖已经成为天然药物的一个新来源。
香菇是一种食用和药用真菌,自古以来就被当作健脾益气,调和阴阳,补虚扶正,行气活血的上品。
其主要有效成分香菇多糖,经二十多年的研究和应用,证实其具有显著提高免疫力,抗癌,抗病毒,降血脂,防止动脉硬化,抗衰老等多种功能[4]。
此外,香菇多糖还具有诱发干扰素和保肝等作用。
因此,近年来在国内外形成了一股研发香菇多糖的热潮。
目前,国内的香菇多糖产品有两种,即"
口服香菇多糖"
和"
肌肉注射香菇多糖"
国外的香菇多糖产品有"
粉针静脉注射香菇多糖"
由日本独家生产。
由于香菇多糖是高分子化合物,分子量大,不易透过血管壁而被吸收,致使口服和肌肉注射的疗效远不如静脉注射.为此,我国和世界其他国家均向日本进口该产品.国内目前有数家单位在致力于静脉注射香菇多糖的开发,虽然现已取得较大进展,但是由于静脉注射香菇多糖要求的纯度高,一般实验室水平达不到要求,因此,研发高效,经济的香菇多糖的方法具有重要的现实意义。
原理
利用深层液体发酵培养香菇菌丝体后，从发酵液中提取菌丝体，从而得到胞内香菇菌丝体，再从菌丝体中，利用它在酒精和水，及酶液的不同溶解度来提取胞内多糖。
将菌丝体抽提、浓缩、离心，取上清液脱色透析，透析液再浓缩、离心，最后用溶液沉淀、洗涤干燥而成。
工艺流程
无论何种提取法，其主要步骤基本相同：
预处理→浸提（多糖与细胞分离）→过滤→浓缩→醇析→干燥→粗多糖
2下面简略介绍各种方法
2.1热水浸提法
这是最早采用的一种传统方法：
香菇多糖溶于水，热水浸提时，香菇组织细胞膨胀破裂，多糖成分浸出。
热水浸提香菇多糖，浸提时的料液比、温度、时间、pH、醇析时的乙醇添加倍数及提取次数是影响多糖得率的主要因素。
对料液比而言，若加水太少，提取不彻底；
加水太多，容易降低提取液的固形物含量，不利于以后的分离，且加重了工业生产中的后续工艺，一般为1：
20左右。
对温度来说，随着提取温度的升高，粗多糖得率逐渐升高，在80％一95％时达到高峰，再提高温度时，粗多糖得率升高趋势趋于平缓，考虑到高温会破坏多糖的结构，影响其生物活性，同时高温提取对工业化生产的设备要求更严格。
所以，提取温度一般以80℃一95℃为宜。
随着提取时间的延长，粗多糖得率逐渐增加，0．5h一3h之间趋势明显，继续延长提取时间，多糖得率加趋势逐渐趋于平缓，一般浸提时间为8h一12h。
热水浸提时的pH为自然pH值，大约在6—8之间。
而对醇析时提取液的乙醇浓度来说，随着其逐渐升高，多糖得率亦逐渐增加，但乙醇浓度达到75％后再继续添加乙醇，对粗多糖得率的影响不大，所以提取液的乙醇浓度最好不超过75％。
当然，提取次数对多糖得率也有一定的影响，多糖得率随着提取次数的增加而增加，但提取次数超过2次后，多糖得率增加缓慢，趋于平缓。
我们通常可以确定2次提取为比较适宜的提取次数[5]
总的来说，热水浸提法的最佳提取条件由具体的实验环境而定，一般可根据正交实验确定。
应注意几点：
（1）浸提过程必须充分，这是前提。
（2）浸提后过滤时应尽量趁热过滤，否则温度降低，物质问的黏度增大，过滤时间增长。
（3）浓缩过程受仪器影响较大。
一般旋转蒸发仪是一种较好的浓缩装置。
2．2稀酸（碱）浸提法
从香菇中提取多糖的提取剂有：
酸液、碱液、酶及热水等，提取剂为酸（碱）时，即所谓的酸（碱）提取法。
该法提取香菇多糖也受多方面因素的影响：
酸（碱）溶液的浓度、作用时间等。
一般情况下，0．4mol／L的HC1溶液在40~C一60℃范围内，多糖得率较高[6]。
需注意，香菇多糖的提取应避免在强酸、强碱溶液中进行，否则极易造成香菇多糖中糖苷键断裂及构象变化而形成较多单糖，影响多糖得率，因此香菇多糖较少采用此法提取。
2.3酶解法
香菇细胞壁主要由纤维素、果胶等组成，细胞膜主要由蛋白质和磷脂组成，因此我们可以用具有专一性和高效性的酶，如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等来提取香菇多糖。
近年来有报道用链霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等处理后，再经透析能得到基本无蛋白质及小分子杂质的香菇多糖。
酶解法就是指在浸提的过程中加入相应的酶来水解纤维素、果胶、蛋白质分子等，以使多糖从细胞中分离出来。
此环节影响多糖得率的主要因素有：
酶用量、酶作用时间、作用温度和pH。
酶的用量太少，不能彻底水解香菇细胞壁中的纤维素、果胶和细胞膜中的蛋白质，从而不能使多糖从细胞里更好的分离出来，降低多糖得率；
酶太多，多糖量增加趋势趋于平缓，而造成原料的浪费酶制剂的作用时间也要适宜，过短，酶不能充分水解纤维素、果胶、蛋白质等，使得多糖得率降低；
过长，多糖的量不会继续增加，同时浪费时间，造成生产上的不必要浪费。
当单因素考虑时，一般我们认为，纤维素酶的最适反应浓度为0．5％，最适反应时间为80min，最适反应温度为50℃一60℃，最适pH为5．0；
果胶酶的最适反应浓度为0．5％，最适反应时问为80min，最适反应温度为35cc一45℃，最适pH为4．5；
木瓜蛋白酶的最适反应浓度为1．0％，最适反应时间为60min，最适反应温度为50℃一60℃，最适pH为4．5。
众所周知，温度和pH值会极大的影响酶的活性，高温、过酸、过碱，都会使酶失去活性，这些都不利于酶活性的发挥。
因此，具体的环境，我们应该通过实验找出最适酶用量，作用时间，温度和pH值，这样不仅能达到香菇多糖的最大得率，而且省时，经济。
除以上因素外，酶的类别和向预处理液加入不同酶的先后顺序也会影响香菇多糖的得率。
香菇细胞壁具有全透性，小分子物质如水、乙醇等及大分子物质如多糖、蛋白质等能自由出入；
细胞膜具有半透性，只允许小分子物质通过。
当细胞壁被水解后，细胞膜在一定条件下通过渗透吸水破裂，细胞内多糖等物质流出。
同时，环境因素如pH、温度等也可使细胞膜破裂。
当用蛋白酶提取香菇多糖时，蛋白酶透过细胞壁，与细胞膜接触，水解膜蛋白从而破坏膜结构，香菇多糖得以析出；
当用纤维素酶处理时，在适宜条件下，细胞壁被水解，同时细胞膜由于吸水或外环境因素的影响而破裂，多糖类物质流出。
一般情况下，用复合酶提取效果明显高于单酶的提取，这是因为香菇细胞壁主要由蛋白质、几丁质和纤维素等构成，很坚固；
使用纤维素酶，果胶酶和蛋白酶先后水解，共同作用于香菇的细胞壁，使其破裂，多糖易于从胞内释放，比单一酶作用提高了香菇多糖的得率。
但是，若蛋白酶和纤维酶同时使用，由于各自的最适条件不同，不能达到最佳水解效果，同时蛋白酶对纤维素酶具有水解作用，所以有些文献报道双酶水解与用纤维素酶单酶水解相比，效果没有明显提高。
刘宁和李健（7）纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别两两组合成复合酶，研究其提取效果，结果如表1：
表1复合酶提取香菇多糖
复合酶
纤维素酶+木瓜蛋白酶
纤维素酶+中性蛋白酶
木瓜蛋白酶+纤维素酶
中性蛋白酶+纤维素酶
多糖得率（%）
12.90
7.02
9.46
6.34
由此可知，木瓜蛋白酶的提取得率明显高于纤维素酶和中性蛋白酶的得率，其中尤以纤维素酶+木瓜蛋白酶处理效果最佳。
木瓜蛋白酶也是目前所知道的一种十分适合香菇多糖提取的酶，这是因为它有特殊结构：
它是一种含疏基（一SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
因此，复合酶解法是一种较好的提取法，很有发展前景。
在具体提取多糖时，应注意不同酶的选择及组合，同时结合相关环境条件，筛选制定出最佳提取方案。
2.4微波法提取香菇多糖
微波提取法是一种新型提取法，由于溶剂及细胞液吸收微波能，微波射线辐射于溶剂并透过细胞壁内部
时，细胞内部温度升高压力增大，当压力超过细胞的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的多糖就从细胞中释放出来[8]。
在微波法提取多糖的实验中，影响多糖提取率的主要因素有：
微波功率、提取时间以及提取次数等。
随着微波功率的提高，加热速度增大，分子运动速度加快，渗透、扩散及溶解速度加快；
同时，高功率的微波引起细胞内部的结构变化，加速香姑多糖由外层细胞转移到溶液中。
所以，随着提取功率的升高香菇多糖的得率升高，当功率超过40％时，多糖增加趋势趋于平缓；
当功率达到60％左右时，多糖部分会被碳化。
所以，微波功率一般为700w至900w。
对微波作用时间而言，随着时间的延长，多糖得率先上升，而后又下降。
这可能是因为微波辐射时间加长，香菇多糖慢慢分解，逐渐被氧化而造成多糖的损失。
因此，微波作用时间也很重要，应根据所用微波功率和处理的样品量来决定适当的作用时间。
而微波提取的次数也会对其产率有一定的影响。
随着次数的增多，多糖得率增加，但到了一定程度后，变化不大，考虑到提取次数增多，工艺操作复杂，水溶剂用量增加，过滤和浓缩困难，因此，提取次数不宜过多，通常为2至3次[9]。
2.5超声波提取法
香菇多糖的超声波（20KHz-50MHz）提取—利用超声波的空化作用分散破坏植物组织，加速植物多糖成分
的浸出提取；
另外超声波产生的机械振动、乳化和击碎效应等也能加速多糖成分的扩散释放并充分与溶剂混合，提高香菇多糖的得率[10]。
另外，超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应发生，浸提的多糖的结构和性质不会发生变化。
所以用超声波提取香菇多糖可大大地缩短提取时间，减少料液比和降低提取液的粘度，而提取液粘度的降低有利于超滤分离时降低浓差极化的影响，从而提高多糖得率。
超声波提取香菇多糖应注意超声时间、超声温度、超声功率的选择：
一般超声时间为20rain-40min，超声温度为65℃一70℃，而最佳超声功率为80W左右。
目前，超声波逐渐被广泛应用于天然产物的提取，如超声波提取中草药有效成分如皂甙类、生物碱、黄酮类成份等。
2.6深层发酵培养提取法
目前，香菇多糖主要从香菇子实体中提取。
人工培养香菇子实体，生产周期长达半年以上，而深层培养发酵法获得香菇菌丝体和香菇多糖，生产周期将缩短至一周左右；
一般从鲜香菇中提取多糖，得率为6．9％左右，从干香菇中提取多糖，得率是6．72％左右，差异不大；
而香菇菌丝体的多糖得率却明显高于香菇子实体，达7．3％左右。
因此在工业生产中，此法很具竞争优势。
其发酵工艺及主要提取过程：
香菇保藏菌种→斜面母钟→摇瓶菌种→种子罐培养液→发酵液→（上清液胞外多糖）、菌丝体（胞内多糖）
多糖的后续提取工艺同一般方法，只是胞外多糖提取时，其浓缩液要进行透析处理，其他各步骤基本相
同。
总之，该法生产周期大为缩短，在市场竞争中占据很大优势，符合现代工业生产方式。
香菇发酵较细菌，放线菌，酵母菌发酵时间长，极易感染杂菌，因此，工艺全过程的无菌控制是深层发酵培养成败的关键。
2.7总结
通过对上述6种提取方法进行分析比较，发现复合酶解法、微波法、超声波法有较高的提取效率，明显优于热水提取法，但实际生产中还存在许多问题，需进一步改进提高；
深层培养法生产周期短，但易招致杂菌污染，所以各种方法均有其优缺点。
实际生产中，为降低成本，提高效率，以上方法可结合应用，如热水浸提结合超声波、复合酶法结合微波提取、深层发酵培养结合稀酸（碱）法等等，这样提取效率比单一方法高许多。
随着香菇多糖提取方法的不断深入研究，今后会涌现出更多更好的方法，高效率的提取出更多的香菇多糖为人类服务。
深层发酵液中香菇胞内、胞外多糖的提取
3实验材料与方法
3.1材料与设备
香菇菌种7402（由江苏省微生物所提供）、香菇发酵液、无水乙醇（AR）、氢氧化钠（AR）、硫酸（AR）、苯酚（AR）、薄膜旋转蒸发仪、离心机、组织捣碎机、凯氏定氮仪、精密数显PH计、7230分光光度计。
3.2实验方法
3.2.1香菇发酵液制备
以酒精废液、玉米粉、葡萄糖为原料，25L发酵罐，28℃，通气量1：
0.45，150r/min条件下，发酵96h制得。
3.2.2.香菇发酵液中胞外多糖的提取方法—乙醇沉淀法
胞外多糖的一次性提取：
取一定量的发酵液在搅拌下，一次性缓缓加入80%浓度的乙醇，然后置冰箱中沉淀，过夜，30000r/min，离心，沉淀即为粗多糖。
胞外多糖的分步提取：
取一定量的发酵液在搅拌下缓缓加入乙醇到30%浓度，在冰箱中沉淀过夜，3000r/min，离心得粗多糖沉淀，往上清液中继续缓缓加乙醇到60%浓度，同法离心后得粗多糖沉淀，最后再往上清液中继续加乙醇到80%浓度，离心后得粗多糖沉淀。
3次沉淀相加即为分步提取所得粗多糖的总量。
3.2.3香菇菌丝体胞内多糖的提取
湿菌丝体加适量蒸馏水，用组织捣碎机破碎后，在95-100水浴中回流提取3h，离心后将沉淀重复上述操作提取2次，合并上清液，浓缩后按胞外多糖的提取方法进行。
3.2.4粗多糖中蛋白质含量测定
采用半微量凯氏定氮法。
4结果与讨论
4.1发酵液中胞外多糖的提取工艺
4.1.1乙醇分步沉淀法和一次性沉淀法对粗多糖得率的影响
乙醇沉淀法提取多糖时，乙醇的浓度及提取方式对多糖的得率影响很大，一般情况下，多糖的分子量越大，被沉淀下来所需的乙醇浓度就越小。
以30%、60%和80%的乙醇浓度，分一次性沉淀和分步沉淀两种方式进行实验，结果见表1和2。
表1不同浓度乙醇一次性沉淀对粗多糖得率的影响
乙醇浓度（g/L）
粗多糖的率（g/L）
总氮含量（%）
30
1.1
0.949
60
3.0
0.848
80
2.0
1.14
表2不同浓度乙醇分步沉淀对粗多糖得率的影响
1．1
1.25
0.64
1.0
0.448
总的率（g/L）
3.35
2.04
从表1可以看出，乙醇浓度对多糖得率的影响很大，在低浓度乙（30）时沉淀下来的主要是高分子量的多糖和杂蛋白，在60%乙醇浓度时，沉淀下来的是中等分子量的多糖，杂蛋白相对来说少一些，而在更高浓度下沉淀下来的则是较小分子量的多糖和低聚糖，还有一些蛋白质和多肽，故得率较低，且总氮含量较高。
造成80%沉淀粗多糖降低的原因可能是有些多糖分子与醇溶蛋白相结合，随着乙醇浓度的增加，这些醇溶蛋白分子溶于乙醇中从而使多糖也随之溶于乙醇溶液中，不被沉淀下来，造成粗多糖得率的降低。
所以从表1中可看出，并非是乙醇浓度较高，粗多糖得率越高。
从表2的分步沉淀实验结果可看出，分步沉淀不仅能提高粗多糖的总得率，而且还起到一定的纯化作用，使后续部分的总氮含量明显减少，纯度提高，这为以后的纯化精制提供了方便。
4.1.2溶液PH对多糖得率的影响
溶液的PH不仅影响多糖的溶解度而且影响多糖的稳定性。
一般认为溶液在中性时多糖较稳定。
表3是不同PH下的多糖得率。
表3不同PH对多糖得率的影响
PH值
4.0
3.37
6.0
3.65
7.0
3.70
不同的多糖因其组成单糖不同，其最佳提取PH值也不同，从表中可见，香菇多糖提取的最适PH为7.0。
4.1.3温度对多糖得率的影响
由于多糖在溶液中的溶解度随温度变化较大，我们采取不同温度来提取多糖，结果见表4。
表4温度对多糖得率的影响
温度（℃）
4
3.80
25
3.45
注：
此处多糖得率为分步沉淀的总得率。
实验结果表明，低温提取的得率要比25℃高，这是由于多糖在不同温度下溶解度不同造成的，而且低温提取更有利于保持多糖的活性。
以上实验结果表明，在沉淀温度4℃以下、沉淀PH=7的条件下，采用乙醇分步沉淀法从香菇发酵液中提取胞外多糖可使粗多糖得率从一次性沉淀的3g/L,提高到3.8g/L。
4.2香菇胞内多糖的提取工艺
4.2.1几种香菇胞内多糖的提取方法的比较
参考国内外已有的研究资料，本文首先采用三种方法对提取香菇菌丝体胞内多糖的得率进行了比较：
A、将湿菌丝体不做任何处理，直接加水在95℃-100℃热水浴搅拌提取：
B将菌丝体烘干，粉碎，加水提取；
C将湿菌丝体用组织捣碎机捣碎后，加水提取。
结果见表5。
表5不同提取方法对多糖提取率的影响
方法
多糖的率（g/L干菌体）
A
6.00
B
8.50
C
12.62
从表5可知，组织捣碎法（C）的多糖得率最高，效果较其他两种方法都好。
所以，本文主要采用了组织捣碎法（C）提取饱内多糖。
5结论
实验通过对香菇液体深层发酵液中香菇胞内、胞外多糖的提取工艺进行了研究。
结果发现，在4℃以下，发酵液PH=7时，采用乙醇分步沉淀法从香菇发酵液中提取胞外多糖可使粗多糖得率从一次性沉淀的3.0g/L提高到3.8g/L。
将湿菌体用组织捣碎法香菇多糖得率最高。
微波技术提取香菇多糖
3材料与方法
3.1材料与仪器
干香菇（超市）
循环水式多用真空泵（3HB-III）郑州长城科工贸有限公司；
旋转蒸发器（R-201）郑州长城科工贸有限公司；
磁力搅拌器（95-1）上海司乐仪器厂；
分析天平（TG328A）上海天平仪器厂；
微波炉（WL-5001）；
722光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；
常用玻璃仪器。
3.1.1药品
98%浓硫酸（AR）上海振兴化工二厂
苯酚（AR）广州番禺力强化工厂
葡萄糖（AR）汕头市光华化学厂
95%酒精江西二糖厂
3.2方法
工艺流程
干香菇→烘干→磨细→微波加热→抽滤→浓缩→醇析→抽滤→干燥→产品
称取干香菇5g，加入100ml水，用微波炉加热后，抽滤，滤液经旋转蒸发掉一部分溶剂后，再加同体积的酒精进行醇析，抽滤。
滤液再加三倍体积的酒精进行醇析，并置于冰箱中放置一段时间后抽滤，得粗糙产品，称重并计算产率。
3.2.1制作标准曲线
采用苯酚——硫酸法，以葡萄糖果为标准物
称取苯酚固体6g,用适量蒸馏水溶解，有100ml的容量瓶定容，倒出，放置于冰箱中避光贮存。
准确称葡萄糖20mg,于500ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml,各加蒸馏水至2.0ml;
然后假如6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10min后，于490nm测吸光度，以2.0ml蒸馏水
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