几种真菌的分离与鉴定.docx

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几种真菌的分离与鉴定

常见真菌得分离与鉴定

病原真菌得一般特性

真菌（Fｕnｇi）就是微生物中得一个大类,就是一群数目庞大得细胞生物,估计全世界已有记载得真菌有10万种以上、它们得子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征就是具有真正得细胞核,产生孢子与不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其她都有分支或不分支得丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素（或其她葡聚糖）或几丁质得微纤维或两者兼有得细胞壁得有机体。

对人类与动物致病得真菌大约100余种,属于病原真菌。

一、基本性状

（一）形态结构

真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌（yｅaｓt）一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌（ｍold）或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）得不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在3７℃或体内呈单细胞得酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌、

真菌得细胞结构与一般植物细胞相似,有定型得细胞核及完善得细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而就是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。

1.菌丝（Hypｈa）真菌在合适得环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。

芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。

菌丝继续生长并生长分枝,增殖得菌丝交织组成菌丝体。

其中一部分菌丝深入被寄生得物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体、另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。

气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。

菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。

主要见于病原性真菌。

很多非病原真菌得菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。

有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝、

2.孢子生成孢子就是真菌扩大繁殖得一种方式。

真菌孢子得抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。

不经过两性细胞得结合而形成得孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。

常见得无性孢子有5种:

关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢与分生孢子、病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数就是无性孢子。

（1）厚壁孢子:

当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓与胞壁增厚而成,呈圆形。

当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

（2）关节孢子:

菌丝断裂形成长方形两端略钝圆得孢子叫关节孢子。

如白地霉与粗球孢子菌。

（3）孢子囊孢子:

为鞭毛菌与接合菌得无性生殖形式。

孢子囊中所含得孢子来源于分枝菌丝或胞囊梗顶端膨大形成孢子囊,囊内原生质浓缩集聚,割裂而成,一般数目较多,孢子囊形态多样,因种而异、

（4）芽生孢子:

由菌细胞出芽生成,见于念珠菌及隐球菌,前者（类酵母菌）出芽后孢子伸长呈丝状,但不见与母细胞分离,称为假菌丝,在假菌丝上得收缩点也可出芽成芽生孢子。

（5）分生孢子:

就是子囊菌与半知菌得无性孢子,也就是半知菌分类得主要依据,单细胞得分生孢子称小分生孢子,有蒂或无蒂,侧生或游离,分散或成群,圆形、梨形、卵圆形或其它形状,表面粗糙或光滑,或有或无各种纹饰。

多细胞得分生孢子称大分生孢子,有纺锤形、棒形、球棍形、镰刀形及其它形状,两端尖或圆或一端圆,厚壁或薄壁,壁光滑或粗糙,有色或无色,分隔有多有少。

（二）培养特性及繁殖方式

１.培养特性　大多数真菌对营养要求不高,只需要水、盐,简单得氮源及碳水化合物就可生长,一般常用沙堡氏琼脂基（主要成分葡萄糖4%、蛋白胨1％、琼脂２％）培养都能生长、但需要弱酸性（pＨ４~6）、较低孵育温度（2２~２8℃）,充分温度与氧气供应才能生长良好。

侵害内脏得某些真菌在37℃含血得培养基中生长良好、真菌生长都比较缓慢,大多需孵育数天后才成明显菌落,菌落有下列三种类型:

（１）酵母型菌落:

外观湿润稠软致密,类似一般细菌菌落,镜检只见有圆形或椭圆形生芽细胞（例如隐球菌得菌落）。

（2）类酵母型菌落:

外观性状似酵母型菌落,镜检除见有出芽得细胞外,尚可见到假菌丝（例如念珠菌得菌落）。

（3）丝状型菌落:

由多数分枝得菌丝体向上生长组成疏松得绒球状,表面有很多孢子,显示各种色泽,菌落可呈棉絮状　绒球状粉末状或石膏样,其正面与背面可显示各种不同色素,常作为鉴定菌种得参考。

镜检可见有纵横交织得菌丝及各种孢子（例如各种癣菌得菌落）。

2.繁殖方式有多样性,包括出芽增殖,菌丝增长,菌丝分枝与断裂,产生无性孢子及有性孢子进行繁殖,因此它繁殖力很强,但生长速度较慢。

（三）变异性与抵抗力

真菌很容易发生变异,在人工培养基中多次移种或孵育过久,就可出现形态结构、菌落性状、色素以及各种生理性状（包括毒力）得改变,用不同得培养基与温度培养真菌,其性状也有改变,真菌对干燥阳光紫外线及一般化学消毒剂耐受性却较强。

但对热得抵抗力却不强、60℃以上1小时即可杀死孢子及其菌丝,在１％～3％石炭酸、2。

5％碘酊、0。

１％升汞及1０%甲醛中可被灭活。

用甲醛气体熏蒸被真菌污染得衣物用具,可杀灭真菌菌丝及其孢子。

但真菌对一般抗菌素及磺胺药均不敏感。

只对二性霉素、酮康唑、制霉菌素等非常敏感,治疗真菌感染常用此药。

（四）致病性与免疫性

１、致病性病原真菌得致病机制还就是一个未完全解决得问题;根据其侵害部位,主要分为下列两类:

（1）浅部真菌病:

主要由癣菌引起,大多为外源感染,常易侵害皮肤、指（趾）甲及须发等含角质得组织,引起癣症。

（2）深部真菌病:

可由各种真菌引起,包括类酵母菌、二相真菌及丝状菌、侵害粘膜、皮下组织、内脏及脑膜等处,有时扩散全身,主要就是内源性感染,也可由外源传染;前者就是因机体抵抗力降低,如患重病,长期使用免疫抑制剂,广谱抗菌素或放射治疗,患恶性病,严重烧伤等时,造成体内菌群失调,以致常居在体内得某些真菌（如白念珠菌）,甚至平时不致病得环境中得真菌（如曲霉、毛霉）等也会乘机侵害,一些传染性较强得内脏真菌病就是内外源感染。

2、免疫性浅部真菌病一般在血中不产生特异性抗体,病后无免疫保护力,只就是儿童头癣等青春期后头皮皮脂增多时可以自愈,以后不再感染,其她部位癣症治愈后仍可再感染。

深部真菌病虽可产生抗体,但无明显免疫保护作用。

临床常见得病原性真菌

一、浅部真菌

（—）皮肤癣菌

皮肤癣菌又称皮肤丝状真菌,有下列三属（见表１）,都只侵犯体表角化组织（皮肤,毛发及指甲与趾甲）、不侵害深部组织,或内脏,皆属外源性传染,由接触患癣病人、动物（狗、猫、鼠、牛、马等）或染菌物体而感染。

1.毛癣菌属 

＊红色毛癣菌

（1）直接镜检:

皮屑及甲屑,分枝分隔得菌丝有时可断裂或关节孢子状,毛发:

发外型感染表现为发外孢子排列成串。

少数为发内型感染孢子在发内排列成链状;毛发穿孔试验阴性。

（2）培养特征:

在葡萄糖蛋白胨琼脂,25℃,生长比较快,菌落形态有多种表现,镜检也不完全一样,常见有下列四种:

I型:

羊毛状:

白色羊毛状菌丝充满斜面,典型得卷成筒状,边缘贴牢管壁,呈鲜红色,背面开始在中心有一红色小点,以后形成深红色环,最后成片为葡萄酒色,色素边缘划界非常明显。

少数Ｉ型菌株表现无红色色素,正面白色,背面呈淡黄色类似石膏I型,亦有正面白色而背面呈灰黑色。

II型:

绒毛状:

粉红色绒毛状菌丝生长,占斜面３/5,菌丝稀疏,透过菌丝可见粉红色得基底,背面颜色同I型相同、IＩＩ型:

粉未状:

菌落表面稍有凸起,呈粉末状,粉红色,约占斜面得１/2～2/3,背面同I型。

IV型:

沟纹状:

菌落生长相对较慢,比以上三种类型为小,占斜面得１／３~1／２,菌落中央凸起,从中央向四周有排列比较整齐得放射状沟纹,边缘整齐,表面菌丝甚少。

开始微带黄色,以后变粉红,背面同I型。

（3）菌种鉴定:

①菌落特征及色素;②大小分生孢子得形态;③玉米粉吐温琼脂上产生红色色素;④毛发穿孔试验阴性;⑤尿素酶试验阴性。

*须癣毛癣菌

（1）直接镜检:

皮屑内见分枝分隔得菌丝,甲屑内为关节状菌丝。

毛发感染为发外型,发内有时有菌丝。

（2）培养特性:

在沙氏上生长较快,菌落形态可分为两大类:

毛型与粉型;下列Ｉ、IＩ型为毛型,III、IV、V型属粉型、自炎症明显得皮损中所分离出得菌株多属粉型。

毛型菌落外观均似红毛,应注意鉴别。

具体分型①羊毛状（I型）,又称趾间毛癣菌,菌落生长快,白色羊毛状、气生菌丝较多且长,排列紧密,充满斜面,好象红毛,正面雪白,背面淡黄色。

镜检见较细分枝,分隔得菌丝,胞浆浓。

有少量球形或长形小分生孢子,无螺旋菌丝与大分生孢子、间或可见球拍菌丝及结节菌丝。

②绒毛型（II型）,生长快,菌落雪白。

表面有紧密得细短气生菌丝,中央可有乳头状突起,边缘如刀切,背面棕黄色或棕红色。

镜检见较细得分枝、分隔得菌丝,小分生孢子多,有时成葡萄串状,无螺旋菌丝或大分生孢子;③乳皮状（III型）,开始为乳白色菌丝,不久一部分菌落变为粉末样,色微黄,光滑,似牛乳表面得一层薄膜,可一块块地挑取,中央有少许褶叠,边缘不整齐,背面淡黄或棕黄色。

镜检见粗细不一,分枝分隔得菌丝与大量螺旋菌丝,间或可见破梳状菌丝,结节菌丝及球拍菌丝,大分生孢子少,棒状,两端圆,与分生孢子梗得连接处较窄,薄壁光滑,小分生孢子多,球形或长形,有时成葡萄串状排列。

④粉末状（IV型）,菌落粉末状,表面平坦、光滑。

间或有少数白色气生菌丝,中央有乳头状凸起,边缘锯齿状。

菌落生长快,充满斜面,色黄或奶油色,外观像石小、背面棕黄或棕红色、⑤颗粒状（V型）:

生长快,菌落粉样,表面不平,呈颗粒状、有不规则得褶叠或沟纹,边缘不整齐。

下面色黄带红或棕黄。

背面棕红色。

IV、V镜检均见大量棒状大分生孢子及无数圆形得小分生孢子,少数长型。

游离或葡萄状成串,有螺旋菌丝与球拍菌丝、

（3）菌种鉴定:

①菌落形态;②菌丝较细,就是皮肤癣菌中最细得一种;③螺旋菌丝多见;④大分生孢子得形态与球形小分生孢子;⑤尿素酶阳性;⑥毛发穿孔阳性。

＊紫色毛癣菌

（１）直接镜检:

皮屑、甲屑内可见分枝分隔得菌丝或成串得孢子,病发取黑点部位得断发,毛发损害为发内型大孢子,呈关节型排列,充满整个发内,故毛发出皮即断。

（2）培养特性:

在沙氏琼脂培养基室温培养菌落生长慢,开始为圆形、白色、潮湿发亮得菌落,类似酵母;以后中央褶叠或突起,产生紫色色素,并逐渐扩大,或中央紫色,边缘淡红色,最外围有一圈白色得环。

培养基颜色不变,边缘无放射状菌丝,整齐如刀切,下沉不明显,背面无色至深紫色,少数菌株无颜色,呈无色紫色毛癣菌,镜检见粗细不一得菌丝,分隔较密,胞浆淡,有很多不规则得突起与肿胀,但无鹿角菌丝。

厚壁孢子多,多为间生,偶见小分生孢子2~５个大生分生孢子。

（3）菌种鉴定:

①菌落形态,紫色色素;②VｉtB能促进菌落生长,形成大分生孢子;③发内型感染。

2。

小孢子菌属

＊羊毛状小孢子菌

（1）　直接镜检:

皮屑内见分枝、分隔得菌丝,病发为发外型感染。

（2）培养特性:

在沙氏琼脂培养基上室温生长快、开始为黄色绒毛样生长,2周后菌丝较多,呈羊毛状,可充满大部分斜面。

中央趋向粉未化、正面桔黄,背面红棕色,平皿中培养得菌落表面中央可有少数同心园,无放射状沟纹。

生长约4-5周后开始变异,菌丝增多,大分生孢子减少或消失。

镜检见大量纺锤形,厚壁得大分生孢子、一端稍弯曲,末端有帽样肥大,有6—15个分隔。

小分生孢子较少,长形,无柄侧生、可有球拍状菌丝,破梳状菌丝,结节菌丝及大量厚壁孢子等。

（3）菌种鉴定:

①菌落形态及色素,在PDA培养基上能产生黄色色素;②特征性得厚壁、顶端膨大微弯曲,如戴帽得大分生孢子;③发外孢子型感染。

＊石膏样小孢子菌

（１）直接镜检:

皮屑内见菌丝或成串得孢子,病发为发外型感染,孢子较大,排列成串。

（2）培养特性:

在沙氏琼脂培养基上室温生长快,开始为白色菌丝,后成棕黄色粉未状菌落,凝结成片,菌落中心有隆起,外围有少数极短得沟纹,边缘不整齐,背面红棕色、镜检:

见多数较小,纺锤形,4~６个得大分生孢子,