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Chen等[9]2003年对不同培养条件下草菇（Volvariellavolvacea）漆酶活力的变化做了相关研究，总结得出在已知培养基中以葡萄糖为唯一碳源或以棉花废弃物作为工业化规模培养时，浸液培养会产生多种类型胞外漆酶。

在液体培养时，酶的合成与菌丝体的次级生长阶段密切相关，并且受铜离子（高达200μMCuSO4）和各种酚类化合物的调控。

固体培养时，营养生长阶段只能检测到少量的漆酶产生但是在营养体生长初期和子实体生长阶段检测到漆酶活力有极大的提高。

2004年Chen等又对草菇漆酶基因的克隆、测序及生化和分子生物学特征做了更深入的研究，对于漆酶的研究深入到分子方面[10-11]。

（2）漆酶的类型

根据真菌漆酶生成方式的不同，也可以将其分为诱导型和组成型两种。

组成型漆酶在菌体初级生长阶段即已生成，其生成量一般较少受诱导物影响，在不加诱导剂的情况下，也可产生较大量的漆酶，有的甚至有抑制作用，这可能是由于芳香类小分子诱导剂大多具有一定毒性，影响菌体生长。

诱导型漆酶生成于菌体次级生长阶段，酶活水平受某些特定化合物诱导，是真菌漆酶生成的主要方式。

大多数真菌漆酶均为诱导型，酶活水平易受营养条件和某些理化因素影响。

漆酶的诱导剂多为酚类底物类似物，但不同菌株有各自产酶的最适诱导物[12]。

许多情况下，特殊的生长条件（例如添加诱导物或促进蛋白合成的物质、高或低氮源浓度、在黑暗或光照下）对于获得大量的漆酶是非常必须的[13]。

1.1.2漆酶的生物学特性

（1）漆酶的结构特征

真菌漆酶是一种胞外糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu2+三个部分组成。

分子量在60-80kDa之间。

肽链一般由500-550个氨基酸组成，糖配基主要有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10%-80%。

糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因[14]。

多数漆酶含有四个Cu2+，一个I型Cu2+（TypelCu，简称T1Cu），一个II型Cu2+（Type2Cu，简称T2Cu）和两个III型Cu2+（Type3Cu，简称T3Cu）（如图1-1）。

T1Cu又称蓝色Cu2+，与Cys的S配位结合形成的共价键Cu-Scys在600nm处有强吸收值，使酶分子呈蓝色。

漆酶分子中一个T1Cu形成一个单核位点参与还原性底物的结合和氧化作用，并进行电子转移。

两个T3Cu由一个羟基桥相偶联形成双核并与一个T2Cu结合成一个三核中心（T2/T3）。

漆酶的第二个底物氧分子结合于两个T3Cu之间，三核中心接受来自T1Cu单核位点的电子，将氧分子还原为水分子[15]。

KarhunenE等研究的射脉菌（Phlebiaradiata）漆酶只含有2个Cu2+，另外含有一个有机小分子辅基吡咯喹啉醌（pyrroloquinolinequinone,PQQ），该辅基在分子中具有类似III型Cu2+的功能。

PalmieriG等[16]从糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）中纯化的一种新型漆酶POXAI只有一个Cu2+，却含有二个锌原子和一个铁原子，由于缺少T1Cu，在600nm处没有吸收峰，酶蛋白呈白色。

（2）漆酶的理化性质

近些年来,约有多种不同来源的漆酶得到提纯，并对其性质作了进一步的研究。

均为单体酶，酶分子中一般都含有4个铜原子；

适宜反应温度较低,酸性pH催化效率较高；

但是，酶的一些性质的局限性如氧化还原电位和pH等妨碍了它的有效作用，因此有必要对酶的空间结构进行适当的改造[17]。

XuF等[18]利用定点诱变的方法对真菌Myceliophthorathermophila和Rhizoctoniasolanis漆酶I型铜原子位点附近的氨基酸残基进行了突变，结果导致了性质的显著变化：

和野生型相比，两种菌漆酶酚氧化酶活性的最适pH分别拓宽了两个单位；

氧化还原电位稍有变化，Km，Kcat及氟化物的抑制作用都有极大的变化。

究其原因，可能是突变导致结构微扰，从而影响了酶与底物的识别能力和电子从底物传递到I型Cu中心。

1.1.3漆酶的研究进展

（1）诱导与抑制

不同白腐菌中存在不同的漆酶转录激活机制，特别是对于那些诱导表达的种类。

结构和木素有关的低分子芳香化合物或木素降解的碎片化合物，对漆酶均有诱导作用[39]，如2,5-二甲基苯胺、对甲氧基苯胺（茴香胺）、1-羟基苯并三唑（漆酶的一种底物）、松伯醇、香草酸、香豆酸、单宁酸、黎芦酸、阿魏酸、咖啡酸、紫丁香醛、地衣酚、甲苯胺、愈创木酚、2,6-二甲基苯酚，甚至天然洋葱、柠檬浆等，这些物质共同的结构特征是芳环连有羟基或氨基。

尤其2,5-二甲基苯胺是最常用的产漆酶诱导剂[40-41]，现已公认它对于变色多孔菌（Ployporusversicolor）的漆酶来说是最有效的，它可提高酶基因的转录水平，从而使漆酶活性升高，作用于Pycnoporussanguineus可使漆酶活性比对照增加50倍以上。

茴香胺诱导Rhizotoniapraticola的漆酶酶活提高30倍[42]。

而1-羟基苯并三唑在酶基因的转录水平上刺激漆酶高活性表达[43]。

在平菇培养基中添加阿魏酸和芥子酸（木质素水解产物），对促进漆酶生成特别有效，这说明木质素降解的中间物或末端产物均能对漆酶的生成有影响，这也即所谓的“反馈作用”[44]。

芳香化合物不仅提高酶产量，还可诱导新同工酶[45-46]。

总之，大量文献报道了这些芳香化合物（通常有毒）在适当时间以适当浓度加入培养基中，可不同程度地提高漆酶活性。

微量元素如Cu、Fe、Zn、Mn、Co等，往往或是酶的活性基组成成分，或是酶的诱导剂，对酶活的影响不容忽视。

其中对漆酶而言最重要的一个是Cu2+。

很多研究均证实Cu2+对漆酶分泌大有促进[43、46]，它也在酶基因的转录水平起作用。

Cu2+存在的前提下，Mn2+对漆酶也有重要影响，不加Mn2+使Agaricuscampestris漆酶酶活显著降低，但如果没有Cu2+，漆酶酶活与Mn2+无关而始终很低。

高浓度的Mn2+还提高Phlebiabrevispora和Phlebiatremellosa的漆酶酶活[47]，但对Dichomitussqualenss来说，漆酶酶活却不受Mn2+的影响[48]。

K+、Zn2+等离子也可提高漆酶活性[49]。

有研究还表明，乙醇也是Trametesversicolor漆酶的高效诱导剂，且在Coriolushirsutus、Grifolafrondosa上得到了相似的结果[50]。

（2）漆酶的分离纯化

近年来，人们对于漆酶的研究不再只停留在对产酶条件、高产菌株的筛选工作，而逐渐转向更深层次的研究，漆酶的分离纯化也成为近几年国内外研究的一个热点。

漆酶蛋白纯化一般采用的方法是：

经过抽滤、超滤、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱和凝胶柱，最后经SDS-PAGE鉴定其纯度，并用分离纯化到的酶进行酶学性质的研究。

2000年，朱启忠等[51]对毛栓菌胞外漆酶经盐析、透析、sephadexG75和G25四步纯化后粗酶液被纯化了39.1倍，比活力12152，回收率45.3%。

同年，韦建学[52]从同一株漆树中得到的粗漆酶经SephadexG-100柱层析（2.5×

60cm2）分离得到两种漆树漆酶同工酶I、II。

再分别经SephadexG-200层析柱进一步纯化将纯化的漆酶同功酶I、II进行理化性质的比较分析。

2001年，E.M.KO[53]等在对30℃摇床培养2天后获得的Ganodermalucidum漆酶粗酶液溶于20mM的Tris缓冲液中（pH7.0），然后将酶液上DEAE琼脂糖CL-6B离子交换层析柱后用含0-0.5MNaCl的Tris缓冲液线性洗脱，将有漆酶活力的用收集器收集后超滤浓缩。

制备凝胶电泳显示有3种同工酶，分别为GaLc1,2,3。

试验结果表明，经过离子交换柱层析、制备凝胶电泳和电洗脱后，GaLc1，2，3三种同工酶的纯度比粗酶液提高了32.4倍，预测分子量均在65-68Kd。

2002年，Saparrat等[54]为了更好的了解白腐菌担子菌Coriolopsisrigida对木质素及脂肪族和芳香族化合物的降解作用，也采用了液体摇床培养的方式制备漆酶酶液，但其在培养的过程中加了150mM的CuSO4作为诱导物以提高产酶量。

粗酶液经过离心、超滤浓缩、透析后经Superdex75柱平衡收集到有漆酶酶活的峰后浓缩、乙酸钠缓冲液（pH4.5）透析后过Mono-Q离子交换柱，20-100mMNaCl线性洗脱后收集有漆酶活性的峰，浓缩后对基本的酶学特性进行研究。

该实验分离纯化到2种漆酶同工酶，均为单体酶，分子量约为66Kd。

Jung等[55]在韩国分离得到的一株可降解木质素的新菌种TrichophytonrubrumLKY-7在以2，5-二甲基苯胺诱导物的葡萄糖—蛋白胨液体培养基培养过程中高效分泌漆酶。

经过3步柱层析后（Q琼脂糖柱层析：

含NaCl的NaAc缓冲液洗脱、含NH4SO4的NaAc缓冲液洗脱、Superdex-75凝胶柱层析）分离到该漆酶：

SDS-PAGE显示该漆酶的分子量约65Kd，纯化得到的漆酶有典型的铜蓝蛋白吸收光谱。

Iye，Chattoo[56]、Saito[57]、Wang[58]等在分离纯化漆酶时均采用了离子交换柱层析和凝胶柱，只是针对菌种的不同，采用了不同的缓冲体系及pH值而已。

要指出的是上述分离纯化漆酶时他们均采用的摇床培养的方式，可能对多数菌种而言，摇床培养既利于菌丝的生长，对于漆酶的分泌表达也有一定影响。

（3）漆酶酶学特性的研究

漆酶基本酶学特性的研究多集中在分子量的测定、等电点、最适pH、最适反应温度、热稳定性、金属离子对酶活性的影响等方面。

漆酶多数为单体酶，采用SDS-PAGE凝胶电泳法确定漆酶的表观分子量，根据已知分子量的标准蛋白Marker在SDS-PAGE凝胶电泳中的相对迁移率Rf，绘制logWm-迁移率图，即可求得其表观分子量[59]。

等电点的测定国内外多采用等点聚焦的方法测定[60-61]。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI[62]。

最适pH及温度的测定，分别设定一系列pH及温度梯度，将酶液与底物在设定环境下测定漆酶酶活，通过作图分析，找到漆酶反应的最适pH及温度。

对于金属离子对漆酶酶活的影响，席丹[63]、刘淑珍[64]、郭伟云[65]、王云忠[5]等实验结果均显示Cu2+对漆酶酶活具有促进作用，而Fe2+、Ag+有抑制作用；

但对于Mn2+、Ba2+等，不同的菌株表现出的作用则不尽相同，比如Ba2+对糙皮侧耳菌漆酶酶活有明显的抑制作用，而对香菇却表现出激活作用；

Mn2+对糙皮侧耳菌漆酶酶活表现出激活的作用，但在刘淑珍的报道中对酶活却没有任何影响。

（4）漆酶的分子生物学

漆酶基因的克隆方面：

随着分子生物学技术的发展，漆酶基因已经从木素降解菌和一些非木素降解菌中克隆并进行了结构分析。

对漆酶编码基因及漆酶基因的表达调控机制的研究，有助于阐明不同漆酶在发育进程中所起的作用。

尤其是漆酶有广泛的应用价值，如制浆和造纸工业中去除木质素，对异生化合物的生物消除，这些用途导致了人们对分离新的漆酶基因、研究其异源高表达和实现大量生产的极大兴趣。

近年来，对于漆酶的研究己深入到分子水平，200多个漆酶基因组DNA和cDNA序列己从真菌和植物中得到分离和鉴定，目前至少有20个以上的真菌漆酶基因已经被克隆和测序[66]。

1988年Frohman等首次利用快速扩增cDNA技术从白腐菌P.ostreatus中克隆到漆酶poxI基因，后来的研究者多用RT-PCR技术来获得漆酶基因。

截止目前，陆续已有约二十种该酶基因得到克隆，一些基因在不同受体菌中甚至得到了表达。

但是，并不是所有的产漆酶菌株中都能克隆到相应的PCR产物，D.souza等从九属11个木腐菌中的基因组中扩增漆酶特异性序列产物，结果得到八个预期产物，而虽然知道F.fomentarius和P.ostreatus中产生漆酶，但是却没有得到任何扩增产物；

不过，根据Southernblotting杂交结果，可以证明这两菌种中确实存在漆酶基因。

其中原因，尚有待研究[67]。

随后很多研究者利用建立基因组文库或cDNA文库，然后设计探针在文库中筛选的方法来克隆漆酶基因。

Coll等运用基因组文库和cDNA文库克隆到担子菌PM1（CECT2971）的漆酶LaccaseI基因[68]。

也有学者利用漆酶铜原子结合位点的保守性，根据其氨基酸保守性设计简并引物克隆漆酶基因。

D′Souza等[69]根据9种担子菌漆酶基因氨基酸N末端的铜原子结合区域设计引物克隆到相应的PCR产物。

真菌漆酶的基因外显子序列长度一般介于1500-2000bp，相应的氨基酸残基数约为500，整体的序列同源性并不高，但是不同酶蛋白中结合铜原子区域的保守性相当高。

基因中含有的相当多的内含子，其中一些也高度保守。

经比较发现，白腐菌T.versicolor、C.hirsutus和P.radiata中的内含子虽然序列同源性不高，但它们在铜结合区域的保守性相当高，而且不同来源的漆酶基因内含子的位置也大多是保守的。

这两方面可以作为分析酶的同源性和菌株间的亲缘关系依据之一。

深入研究T.versicolors的lac1基因，发现其启动密码上游有一个约130bpTATA框和60-90bp的可能和启动有关的富含嘧啶区域，与酶的表达关系非常密切。

漆酶的异源表达方面：

对漆酶基因的克隆和序列分析，实现其高表达是一个重要目的，因此一直有人在研究该基因的异源表达。

1990年KojimaY首次将C.hirsutus的木素降解酚氧化酶进行了克隆和在酵母系统Saccharomycescerevisiae中的表达[70]。

次年Markku等将编码白腐菌P.radiata漆酶基因克隆于软腐菌Trichodermareesei表达系统中，用纤维素酶的启动子来启动该酶基因的表达，表达量达到20mg/L。

另外，A.oryzae和Pichiapastoris系统也成功地表达了若干种不同来源的的漆酶。

但是真正实现漆酶的高表达还有一定的距离。

巴斯德毕赤酵母表达系统是应用较为成功的外源蛋白表达系统之一，它具有真核生物表达系统的特点，能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工，至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达[71]。

2004年，张银波[72]等将漆酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906，转化毕赤酵母GS115且实现分泌表达。

在培养温度20℃，甲醇流加量为1.0%（V/V）的情况下，其分泌表达的金针菇漆酶最高酶活为0.1070U/ml。

2005年，郭梅[73]等将白腐菌杂色云芝Coriolusversicolor克隆得到的漆酶Lcc基因电击转化PichiamethabolicaPMAD16中，摇瓶进行诱导培养，漆酶活力可达53U/L。

2007年，周宏敏[74]等不仅对对栓菌420（Trametessp.420）漆酶基因lacD在巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）进行异源表达进行了研究，而且对产酶条件进行了比较，实验得出具有天然N-末端的重组漆酶rLacDx比和N-末端带有8个额外氨基酸残基的重组漆酶rLacDe活力高；

同种重组漆酶高密度发酵优于摇瓶培养，酶活可提高约2倍且培养周期缩短了近2/3。

不同表达系统漆酶的表达产量不同。

漆酶在酵母中表达量非常低，约为5mg/L；

丝状真菌宿主重组漆酶的产量为10-20mg/L[75]。

1.2.4漆酶的应用

多年来，漆酶的研究涉及到生物、化学、物理、医学、环境等多个学科领域，越来越受到人们的关注。

漆酶可以催化氧化不同类型的底物已达250种，因此漆酶的应用范围非常广泛，在很多方而都显示出了较高的应用价值。

（1）合成方面

研究表明，漆酶在真菌色素合成中扮演重要的角色，并可能参与菌索的形成，它也能在细胞间催化酚类化合物的聚合粘连来固定菌丝。

人们已经利用漆酶的这种粘合功能进行化工行业的开发研究。

在酶的催化作用下，用制浆废水中的木素为原料，可以生产木屑板等产品。

虽然尚未达到大规模生产，但是能有效去除制浆废水中的木素，对水净化的好处是显而易见的[22]。

还有人根据漆酶的催化特性，设计漆酶参与高分子化合物的合成的过程，漆酶参与了氧化固醇类激素芳香环的过程[23]。

（2）造纸工业

漆酶催化木质素降解的特性可用于造纸工业生产，这是漆酶最有前景的应用。

用漆酶选择性降解木质素生产纸浆，可消除高温蒸煮对纤维素的破坏，使生产在温和条件下进行，节约设备和成本[24-25]；

漆酶参与木浆和草浆的漂白都有报道，可提高漂白质量，并且漆酶和一些介体（通常是ABTS）协同作用效果更佳[26-27]。

漆酶与木聚糖酶的协同作用对制浆产生良好效果，对后续化学漂白工序产生有利影响[28]聚酶雨。

另一方面，漆酶处理造纸废水也具有诱人的应用前景。

虽然Lip脱木素效果稍好一些，但漆酶更稳定，固定化后能有效的发挥作用、不需要过氧化氢的参与、有些漆酶可组成型产生且表达量较高、可以更有效的脱氯。

T.versicolor处理氯漂废水的脱色过程就主要由漆酶完成[29]。

Bollag等固定化漆酶处理造纸废水，有效除去其中甲基酚[30]，漆酶还能够脱甲基和部分溶解纸浆中的木素。

（3）环境污染物的处理

漆酶非特异的、高效降解光谱有害物，现已成为多种工业废物处理研究中最为活跃的领域之一。

漆酶加剧五氯苯酚（PCP）等酚类物质及其衍生物的降解[31]，可令多环芳烃几乎完全矿化[32]，还可用于高度稳定的多种染料的脱色。

Elithbeth的试验表明，只有漆酶活力和染料的脱色效果呈正相关，说明漆酶在其中起重要作用[33]。

另外漆酶可使氯代农药彻底分解[34]。

1998年，Amitai等首次阐明了白腐菌漆酶对神经剂VX和RVX氧化生物降解的机制[35]，将有机磷毒剂的降解研究推进到新水平。

漆酶对许多难降解的异生化合物均有良好的降解效果。

（4）食品工业

在食用菌的生产中，木耳、香菇、猴头、多脂鳞伞、亚侧耳、草菇等食用菌中都含有漆酶，由于漆酶所具有的催化活性，使其在食用菌的生产中起着至关重要的作用。

其主要作用有：

参与木质素的降解，为菌体的生长发育提供营养；

参与菌体的呼吸作用，促使菌体生长发育；

利用其对木质素的特殊降解作用，使液体培养菇类成为可能；

在菇类的袋料栽培过程中，参与菌筒转色（漆酶能将菌丝体代谢合成的或基料变化产生的酚类化合物氧化成黑褐色的菌膜）而改善产品质量；

能有效抑制杂菌的污染。

此外，漆酶在饮料的加工[36]、食品成分的检测方面均有应用。

5）其他

漆酶在氧化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易被转化为电信号而高灵敏的得到检测，已有不少漆酶在生物检测中应用的报道。

漆酶传感器现已用来检测多种底物体系中的多酚、多氨基苯及多类生物活性成分等物质[37-38]，包括饮料、工业污水、医学样品等，测量快速精确。

1.2漆酶中的信号肽对漆酶在酵母中的表达影响

为了便于漆酶的纯化、降低被内源性[11]蛋白酶降解的风险和对酵母生长的影响,常采取胞外表达的策略,选用的信号肽为酿酒酵母的α因子信号肽或漆酶基因上的本地信号肽。

对于S.cerevisiae,采用α因子信号肽一般比漆酶本地信号肽得到更好的表达效果lipolytica[26]等由此可见利用酵母表达漆酶时,最合适信号肽的选择不能预测。

1.3巴斯德毕赤酵母表达系统的生物学特点

巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核生物基因表达系统之一。

它具有以下特点

（1）能够在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时利用甲醇作为唯一碳源快速生长。

因为它含有乙醇氧化酶基因（AOX），其强启动子受到甲醇的严格控制，特别适合于外源基因的调控表达。

（2）醇氧化酶是甲醇代谢途径中的第一个酶。

当细胞以葡萄糖、甘油和乙醇为碳源生长时，不能检测到AOX的活性；

但在甲醇培养的细胞中，该酶可占细胞可溶性蛋白的30%以上，所以能够使外源蛋白质在它的控制下高效产生。

（3）AOX1基因严格地受甲醇的诱导和调控，AOX2基因与AOX1基因序列相似，有92%的同源性，其编码蛋白质有97%的同源性。

AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用。

甲醇能诱导AOX的合成，而甘油和葡萄糖则抑制AOX的产生，只有在去除其它能源后，利用甲醇诱导才能启动AOX基因的信号转录和翻译。

由于以上的生物学特点，使得毕赤酵母对外源蛋白的表达十分有利，其优点表现在以下三个方面量高。

由于表达载体利用的醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度快，所以该系统表达的外源蛋白产量很高，如破伤风毒素蛋白在毕赤酵母中的表达量可高12g/l，明胶的表达量达到了14.8g/l。

该表达量与目前常用的外源蛋白表达系统相比是一个重大的突破。

②稳定性好。

由于该系统表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合在毕赤酵母的染色体上，所以构建的重组菌株很稳定。

③高分泌。

酿酒酵母作为一种传统的基因表达系统，其中的一些分泌信号和先导序列的分子生物学特性已经研究得十分清楚，而且在现代分子生物学中应用也相当广泛。

毕赤酵母基因操作技术和酿酒酵母非常相似，有报道指出人血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量可达l0g/L，这在已知的分泌表达中是十分少见的。

另外，毕赤酵母本身分泌到培