基因工程笔记Word文档格式.docx

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EK1：

在自然环境中一般都要死亡。

EK2：

在自然环境中无法存活。

EK3；

应该是失去了自我迁移的能力。

（3）载体的安全

应该是失去了自我迁移的能力。

不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。

（容易构建）。

如pMB9，pBR322等

基因工程的应用ppt20页左右

第一章基因操作的主要技术原理

第一节DNA的提取与纯化

第二节DNA的凝胶电泳

第三节核酸的分子杂交

第四节基因扩增技术---PCR

第五节DNA序列分析

第六节酵母双杂交系统

DNA的提取与纯化DNA的提纯有很多方法。

其中最常用的是碱抽提法。

原理

闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；

染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

所用的试剂作用

①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。

在碱性条件（pH>

8）下有活性

②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解

③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。

④NaOH-SDSNaOH：

强碱，提供pH>

12的碱性条件，使DNA双链变性。

SDS:

溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。

⑤NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。

用来中和NaOH变性液，使DNA复性，高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀

⑥乙醇用于沉淀DNA，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。

⑦RNaseA降解RNA渣滓。

以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。

⑧TE缓冲液：

DNA保存液。

由Tris-HCl和EDTA配制Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；

EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解

⑨酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。

但苯酚会残留在DNA溶液中。

提取质粒DNA的步骤

溶菌破膜蛋白质和DNA变性中和离心除去沉淀纯化DNA沉淀DNA

溶菌：

使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。

溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，

25mMTris-HCl（pH8.0），

10mMEDTA，

4-5mg/ml溶菌酶，

RNaseA

溶液II

0.2NNaOH，1.0%SDS

溶液III

3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）

影响质粒DNA产量的因素

◆菌株的遗传背景，

◆质粒自身的拷贝数

DNA的定量和纯度测定

1.紫外光谱法（DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。

蛋白质280）

2.琼脂糖凝胶电泳估计（溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。

DNA分子量的估计

一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。

Marker

DNA的凝胶电泳

原理：

1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为移率。

2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。

3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

电场条件相同分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。

闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，

线性分子次之，

伸展开环状最慢。

琼脂糖凝胶电泳（空隙大小决定其分辨分子大小的能力。

聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。

辨别一个碱基差

迁移速率影响因素

核酸的分子杂交

DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。

用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。

探针的标记：

原理:

Southern杂交：

Northernblot：

用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。

Westernblot：

Western杂交的总体过程也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA，这种将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Westernblotting。

几种核酸分子杂交比较

作用材料目的

Southern杂交DNA判断某生物样品中是否含有某一基

因。

NorthernblotRNA检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达。

Westernblot蛋白Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。

原位杂交：

对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落（原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上。

然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。

菌落杂交主要用来从用质粒或Cosmid构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过Southern杂交进一步验证。

通过这种方法在一张直径为9cm的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。

斑点杂交：

斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。

基因扩增指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。

有下列五种方式

PCR体系

进行前先95oC5min

2.PCR技术的原理

PCR的过程：

（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟模板DNA双链完全变性成单链。

（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。

优先的原因是因为引物的浓度高，链短

（3）第三步延伸（extend）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。

（4）第四步变性（denature）94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。

（5）第五步重复（repeat）

反应体系：

（注意添加顺序，考虑经济原则）

Dd水10*buffer氯化镁dNTPSPRIMETAQ酶模板

影响PCR的因素

（1）TaqDNA聚合酶①热稳定性②最适温度高③Taq酶的功能缺点：

具5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。

因此不能修复错误的碱基配对（合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序）④TaqDNA聚合酶的激活剂：

当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。

需做正交试验得到结果。

（2）引物（primer）①位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。

②引物的长度一般引物设计为长15—30bp（按概率与特异性计算得到）③引物的碱基序列：

3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。

5’端另有很多作用④引物的碱基组成：

尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列（形成发夹结构）

；

⑤引物的Tm值：

原始按照计算公式计算，现程序设计。

套嵌引物（nestedprimers）设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。

增加扩增产物的特异性。

（3）dNTPs一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。

浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。

（4）模板（template）①纯度：

但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。

②模板的量：

不能太多，100l反应体系中100ng足够。

PCR技术的扩展

PCR技术的应用

（1）扩增某一段DNA

（2）基因的体外诱变

（3）基因组的比较研究

DNA序列分析

一、双脱氧链终止法

双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3'

位置的-OH缺失。

当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与DNA合成，以其5'

位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的3'

位置的-OH结合，但是，由于它自身3'

位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'

磷酸基无法与之结合。

1.原理

（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。

（2）脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二脂键。

（3）复制反应可以在体外进行。

（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。

技术要点：

（1）制备单链DNA模板

（2）特殊的DNA多聚酶

（3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP。

dNTP/ddNTP=100/1

（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）带有放射性或荧光标记

批注：

①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；

②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。

（高保真）

。

还有很多测序方法：

见ppt。

留意自动测序。

第二章基因工程的酶学基础

一、（II类）限制性内切酶

（1）识别位点4—8bp，回文结构

（2）内切酶与识别序列的结合模式：

二聚体与靶序列结合

（3）切割位点（识别位置处）切开双链DNA。

形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。

（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）：

①5’端凸出（如EcoRI切点）或①3’端凸出（如EcoRI切点）

（5）同尾酶（Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。

如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。

✧DNA末端长度对限制酶切割的影响：

限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性

✧位点偏爱（Sitepreference）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

✧星号（*）活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号（*）活性。

▲：

酶切反应条件;

（1）缓冲液的化学组成

MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和离子强度；

ris-HCl：

维持pH；

二硫苏糖醇（DTT）：

保持酶稳定性；

牛血清白蛋白BSA等：

有助于酶的稳定；

温度：

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。

大多数是37oC，少数要求40-65oC。

反应时间：

反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。

终止酶切的方法：

EDTA+加热+苯酚

EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM；

加热是常用的方法，

对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20分钟可使酶活性大部

分丧失。

对于在80℃作用20分钟也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用

试剂盒纯化DNA。

▲完全消化与局部消化

1）、完全消化：

内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。

2）、局部消化：

只有有限数量的酶切位点被切开。

▲影响限制性内切酶活性的因素:

外因：

外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等

内因：

内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。

构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA

▲位点偏爱（Sitepreference）

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

二、连接酶

两种DNA连接酶大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶

只能连接粘性末端。

不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。

◎连接条件：

（1）必须是两条双链DNA

（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量

▲连接反应的温度：

最佳温度为37度但实际温度为4-16度。

（考虑到氢键的稳定性）

影响连接反应的因素：

1、插入片段与载体的浓度比例（10-20倍）增加机会。

防止自连

2、反应温度4-16

三、修饰酶

▲末端脱氧核苷酸转移酶

用途：

1.同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。

（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA片断的3’端

▲碱性磷酸酶分类

（1）细菌性碱性磷酸酶

（2）小牛肠碱性磷酸酶

碱性磷酸酶的功能1）防止线性化的载体份子自我连接

第三章基因工程的载体

载体：

在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体

基因工程对载体有哪些要求：

（1）在宿主细胞内能独立复制。

（2）有选择性标记。

（3）有一段多克隆位点。

外源DNA插入其中不影响载体的复制。

（4）分子量小，拷贝数多。

（5）容易从宿主细胞中分离纯化。

一、质粒型载体

质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

质粒的类型（大肠杆菌中）

质粒的复制类型

质粒的选择标记及其工作原理

氨苄青霉素抗性（Ampr）

卡那霉素抗性（Kanr）

四环素抗（Tetr）

链霉素抗性（Strr）

氯霉素抗性（Cmlr）

有关质粒载体的构建

天然质粒的局限性

（1）分子量大，拷贝数低2）筛选标志不理想

经典的大肠杆菌质粒载体：

1、pBR322（F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。

（1）元件来源①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。

（2）长度4363bp

（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性

（4）克隆位点24个克隆位点

（5）pBR322的优点

①双抗菌素抗性选择标记（没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。

获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。

②分子小，克隆能力大

③高拷贝数氯霉素扩增后达到1000-3000拷贝

④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。

不能通过接合转移。

3、PUC系列（UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。

属正选择载体。

（1）元件来源①复制起点pBR322的ori②Ampr基因pBR322的Ampr基因③lacZ的启动子大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。

（2）长度约2.7kb

（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

（4）选择标记Ampicillin抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。

蓝白斑选择原理：

①Xgal

②-半乳糖苷酶Xgal显色反应：

-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。

③lacZ的肽互补

1）-肽（lacZ’）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。

lacZ只有在4聚体的状态下才有功能，受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal。

pUC质粒载体上的lacZ’编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。

又能分解Xgal。

产生蓝色物质。

pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点（MCS）区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。

不能互补。

④IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。

能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。

从而互补。

但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽

（5）pUC系列载体的优点

①更小的分子量：

②选择方便

③克隆便利

④测序方便（pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。

由质粒载体演化而来的载体

3.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvectors）

人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

穿梭载体的优点：

①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

二、噬菌体型载体

噬菌体（一类细菌病毒）的一般特性结构：

蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。

噬菌体的生活周期1.溶菌周期：

烈性噬菌体（virulentphage）感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。

2.溶原周期：

温和噬菌体（temperatephage）感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。

形成这一过程称为溶源化（lysogenization）

（整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。

三、单链噬菌体载体

单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：

M13（典型）

1.单链DNA噬菌体的特点

（1）+DNA。

（ssDNA）

（2）复制型（RF）是双链环状DNA。

（3）RFDNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。

并产生噬菌斑。

（4）不存在包装限制。

（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。

2.M13噬菌体

（1）寄主M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。

但M13DNA可以转染雌性大肠杆菌。

（2）DNA长度6407bp

（3）DNA提纯RFdsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。

成熟的噬菌体里只包装有+DNA，也容易提取。

（4）M13的生活周期

（5）没有包装限制

包装过程;

3.M13载体的构建：

（1）克隆区域的选定①基因间隔区（intergenicregion,IG区基因2与5之间507bp）

（2）加入酶切位点

4.M13系列载体的优点

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段

（2）Xgal显色反应，可供直接选择

（3）无包装限制，克隆能力大

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（双酶切）子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。

5.M13载体的缺点

①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降

②实际克隆能力小于1500bp。

虽无包装限制，并非无限包装！

6.噬菌粒载体（phagemidvectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

（1）噬菌粒载体的特点

①分子量小（3000bp）②克隆能力大（可插入10kb外源基因）③两种复制形式（既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。

——既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

2.pUC118/pUC119

①构成1）M13的基因间隔区（带有M13的复制起点）（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：

质粒复制起点AmprlacZ’MCS

②pUC118/119的复制模式

1）双链质粒复制模式每个细胞500个拷贝

2）单链滚环噬菌体复制模式

③噬菌粒载体的包装

1）辅助噬菌体：

自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。

2）包装：

如右图

（5）PCR产物克隆载体

结构：

pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。

②特点MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。

PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。

——Promega公司的T载体系列

四、双链噬菌体载体—载体

1.DNA分子的特点

（1）长度为48502bp；

（2）双链线性DNA；

（3）但在两端有cos位点，可以环化。

DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链互补区域称为cos位点

2.噬菌体的基因组特点

DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。

其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。

3.DNA的复制模型