白血病标准治疗1doc文档格式.docx
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由于人造血干细胞研究的数量限制，目前我们所知道的人造血干细胞的知识多来自体外和人。
虽然人造血干细胞与小鼠的存在重要差异，但是证据表明两者具有共同的基本特征如自我更新的能力、增殖能力、定向分化的能力。
在体外试验中能评价造血干细胞的重要特性，如增殖能力，但多向分化、不断自我更新完成造血的能力难以精确地检测。
严重联合免疫缺陷（severecombinedimmune-deficient,SCID）小鼠缺乏适应性免疫能力，非肥胖性糖尿病SCID小鼠（NOD/SCID）同时缺乏固有和适应免疫能力，能比体外检测更加精确地反应人造血干细胞的特性。
体内检测的精确性可通过输注对照细胞进一步提高。
造血干细胞的免疫表型特征
与定向的造血细胞和成熟血细胞比较，造血干细胞形态上有所不同。
另外，造血干细胞能够通过多参数流式检测与造血祖细胞区分开来。
最常用的富集造血干细胞的免疫标记是CD34。
Terstappen等研究证实CD34+细胞中大约1%不表达CD38抗原。
CD34+/CD38-细胞缺乏定向祖细胞特异性标记（Lin-）基本等同于我们期望纯化获得的多能造血干细胞。
相比之下，CD34+/CD38+细胞异质性较强，包括髓系、红系和淋系祖细胞。
这说明CD38+表达上调是造血干细胞向下分化的标记。
在人胎绵阳模型中，CD34+/CD38-能产生多系的造血细胞维持造血持续进行，而CD34+/CD38+细胞只能短期地造血，说明它代表只是多能造血祖细胞，而不是造血干细胞。
这个研究说明CD34+/CD38-细胞具有很强的长期分化产生多系造血细胞的能力，意味着人体骨髓细胞中存在干细胞群。
另外，造血干细胞还被发现表达高水平的干细胞抗原（SCA-1）和弥漫性糖蛋白（P-gp）,一种位于细胞膜的多药转运蛋白，由多药耐药基因1表达。
另一方面，造血干细胞缺乏或低表达Thy-1.1,CD33,CD71,CD10,CD45RA和HLA-DR，而更加成熟的血细胞却常常表达这些抗原中的一种或多种。
最后，Gunji等研究表明CD34+且c-Kit低表达的造血细胞包含有CD34+/CD38-细胞，而CD34+且c-Kit高表达细胞群常包含有许多粒-单系祖细胞。
造血干细胞表达CD34这一规律近年来被不断挑战，许多研究发现CD34-细胞同样可以完成造血重建。
这些细胞多位于长期培养启动细胞（long-termculture-initiating,LTC-ICs）内。
总而言之，我们在精确鉴定和筛选造血干细胞方面仍面对许多挑战，未来研究主要目标是确定造血干细胞特异性的标记物或组合，以便能从众多细胞中鉴定出造血干细胞。
造血干细胞与造血微环境
骨和血液形成机制传统观点认为是互不相干的，但是强有力证据表明两者联系密切。
造血干细胞位于骨髓中，靠近骨小梁表面，称之为“壁龛”。
越来越多证据表明位于“壁龛”中的间质细胞，尤其是成骨细胞，在调节造血干细胞自我更新、增殖、成熟方面发挥重要作用。
虽然成骨细胞是主要的骨髓间质细胞，但其具体参与骨髓微环境调节造血的生物机制知之甚少。
几个细胞表面受体在控制造血干细胞在骨髓中“壁龛”定位方面发挥重要作用。
例如钙敏感受体（calcium-sensingreceptor,CaR）.研究表明来自鼠胎肝的钙受体缺乏的造血干细胞无法植入到骨髓中。
另外，这些细胞输注到致死性射线照射后小鼠体内，经无法迁移至骨“壁龛”中。
由此可见，钙离子受体在造血干细胞归巢中起至关重要的作用。
另外几个与造血干细胞归巢有关的细胞受体是化学趋化因子4（chemokinereceptor4,CXCR-4）和配体，间质细胞因子（stromal-cellderivedfactor,SDF-1）。
白血病干细胞
两个有趣的观察说明了白血病干细胞的存在。
首先，尽管髓细胞白血病具有高度恶性，其大部分白血病原始细胞只能在体内增殖，而仅有少量原始细胞可在体外形成克隆。
其次，任何个体的白血病细胞尽管形态上十分相似，但其生物学特性存在很大差别。
过去二十年，越来越多证据表明白血病克隆是由一小群干细胞即白血病干细胞，也被称为白血病启动细胞产生的。
一些研究者认为白血病是一类新的异常造血干细胞即白血病干细胞产生的，这种异常的干细胞只能产生原始细胞，停止于细胞发育的某个阶段，不能往下分化。
1994年Dick实验室的研究发现从AML患者中分离出的CD34+CD38-细胞移植到免疫缺陷小鼠体内获得成功，第一次证明了白血病干细胞的存在。
同一实验室后来发现更少量的CD34+CD38-在NOD/SCID小鼠即可诱导出急性髓细胞白血病。
因此，作者认为白血病干细胞和造血干细胞一样具有增殖和分化、自我复制的能力，只不过分化产生的是白血病原始细胞。
随后，白血病干细胞被证明同样存在于慢性髓细胞和急性淋巴细胞白血病。
白血病干细胞仅是众多肿瘤细胞中的一小部分，通常以将其移植到免疫缺陷小鼠内能产生白血病的能力来对它进行定义。
白血病干细胞具有造血干细胞的许多特征，如表1中所示。
大部分化学药物都是周期特异性的，杀伤已分化的细胞，而通常不能清除白血病干细胞。
另外，白血病干细胞生物学特性上不同于由其分化产生的白血病细胞，它有着自己独特的细胞和分子机制调控其行为。
所以，普通化疗药对白血病干细胞无效，这是治疗失败或缓解后复发的主要原因。
另外，白血病干细胞和造血干细胞一样具有“药物泵”P-gp,可将化疗药物从细胞内转移到细胞外，从而逃避杀伤。
表1.1造血干细胞和白血病干细胞的共同特征
处于静止期
自我复制能力
较强的增殖能力
多向分化的潜能
生长于“壁龛”之中
抗凋亡
表达CD34+/CD38+/CD71-/HLA-DR-/
表达Bmi-1
白血病干细胞的起源
来自Dick实验室的数据表明白血病干细胞有着共同的CD34+CD38-表型，能分化、增殖和自我复制，由正常造血干细胞发生白血病转化产生，而不是起源于造血祖细胞阶段。
后来白血病干细胞必须来源于造血干细胞这一假说遭到挑战。
定向造血祖细胞发生基因突变或选择性表达部分基因后可以增强其原本有限的自我复制能力，从而演变成白血病干细胞。
事实上，多个研究报道通过向定向造血祖细胞转染特定的癌基因后可将其诱导成白血病干细胞。
Cozzio等报道向白血病干细胞或粒-巨噬细胞方向分化的髓系祖细胞转染白血病融合基因MLL-ENL然后移植到小鼠体内可产生急性髓细胞白血病（AML）。
这些发现说明短暂性自我复制能力的祖细胞经过MLL基因转化后可具备产生白血病的能力。
这使得一些学者认为白血病干细胞因其来源细胞发生突变的阶段不一样，临床上不同白血病患者细胞的免疫表型、病理特点存在差异。
另外，Huntly等发现将癌基因MOZ-TIF2转入至造血祖细胞可诱发AML，但转入BCR-ABL融合基因却无法得到相同结果。
这些数据表明仅部分而不是所有的白血病基因都能使无永久复制能力的祖细胞转化成白血病干细胞。
后来，Stubbs等发现MLL-AF9和FLTS-ITD联合转染产生的AML恶性程度要高于单独转染MLL-AF9产生的AML。
这些结果支持白血病发生中的”二次打击”学说。
第一次打击导致融合基因的表达（MLL-AF9），随后二次突变引起特定信号通路改变（FLT3-ITD）。
但，应注意到所有关于白血病干细胞起源于祖细胞的数据都是来自动物模型。
BCR-ABL融合基因阳性的白血病干细胞
在慢性髓细胞白血病（CML）中，成熟的白血病细胞及祖细胞与它们的正常成分在形态上没有多大区别，不同的是费城染色体或Bcr-Abl转录本存在于这些肿瘤细胞中。
费城染色体是慢性髓细胞白血病的标志性遗传学异常，是由9和22号染色体长臂异位形成的。
这种染色体异位形成的癌性激酶蛋白Bcr-Abl是CML发病的主要原因。
费城染色体存在于几乎所有造血细胞系中，说明CML起源细胞具有多向分化的潜能。
研究者将从CML患者体内分离出的CD34+恶性原始细胞注入到SCID或NOD/SCID小鼠体内可产生成熟的ph+细胞并完整重演供者疾病的各个时期，是一个很好的CML体内模型。
Holyoake等首先证实了CML中Bcr-Abl+/CD34+细胞亚群在体内和体外都具有干细胞特性。
同一研究小组随后证实那些干细胞免疫表型为CD34+/CD38-/CD45RA-/CD71-，可离开G0期以非细胞因子依赖的方式产生BCR-ABL+子代细胞。
伊马替尼的出现使CML的治疗有了质的飞跃，目前已成为该种疾病慢性期一线治疗的标准用药。
但是仍有少部分慢性期及大多数加速期患者对伊马替尼无效或者很快失效。
越来越多证据显示伊马替尼并没有清除体内的CML干细胞。
完全细胞遗传学缓解患者体内仍可检测出ph+CD34+细胞。
这意味着多数CML患者并没有被伊马替尼根治，这关系到未来复发的问题。
据此，成功清除体内的CML干细胞才是治愈该疾病的根本途径。
最常见的伊马替尼耐药机制是ABL基因突变。
最近研制出的达沙替尼和尼罗替尼是对付这种耐药的好武器，为第二代TKI对CML治疗比伊马替尼更有效。
但仍没有一个临床试验证实这些药物对CML干细胞起作用。
除基因突变外，有几个机制被认为是与CML干细胞对TKI耐药有关，如IL-3受体、G-SCF受体、MDR1表达增加，伊马替尼吸收相关蛋白表达受抑制。
BMS-214662是一种法尼基蛋白转移酶抑制剂，被显示在体外单药或联合伊马替尼、达沙替尼选择性诱导CML干细胞凋亡。
具体作用机制涉及caspase3、caspase8的激活和MAPK信号通路的抑制等。
这一制剂为慢性期CML干细胞的清除提供可能，具有良好的临床试验前景。
AML白血病干细胞
能在NOD/SCID小鼠体内复制白血病的各种原始AML细胞亚群有着共同的独特免疫表型，尽管细胞来自不同的AML亚型患者，除急性早幼粒细胞白血病外，因为该种亚型目前还没发现确切的白血病干细胞表型。
尽管个体之间存在异质性
，多数AML干细胞具有与正常造血干细胞CD34+/CD38-/CD71-/HLA-DR-相同的表型。
但两者也有不同之处，AML干细胞缺乏CD90、CD117表达，而IL-3受体CD123和CLL-1表达。
另外，多数AML干细胞表达CD33，与正常造血干细胞比较CD44在AML和CML干细胞过表达。
总之，AML干细胞与造血干细胞具有共同特征外也有所不同，这恰好可成为针对白血病干细胞治疗的靶点。
ALL白血病干细胞
ALL干细胞的存在是个有争议的话题。
和AML一样，ALL是一种高度异质性疾病，具有不同的临床和基因亚型。
T细胞受体或免疫球蛋白重排支持T和B细胞ALL起源于T或B细胞定向祖细胞。
ALL起源于淋系定向祖细胞由Castor等提出，他们证实了ETV6-RUNX1融合基因使定向B祖细胞发生白血病转化。
Kong等从儿童B-ALL中分离出CD34+/CD38+/CD19+，CD34+/CD38-/CD19+和CD34+/CD38-/CD19-三群细胞注入到NOD/SCID小鼠体内，发现前两群细胞可诱发B-ALL的发生，而第三种细胞群产生的是正常造血。
白血病细胞在肝、脾和肾等脏器浸润程度，在前两种细胞亚群诱发的白血病中没有差别。
另外，CD34+/CD38+/CD19+细胞亚群进行第二次移植仍可诱发白血病，因此作者认为这群细胞具有自我复制能力，是ALL干细胞。
近年来，一些研究揭示部分ALL亚型，其白血病细胞来源于表型原始的造血干细胞，而不是淋系定向祖细胞。
例如，在儿童前B-ALL中，细胞遗传学异常存在于CD34+/CD38-/CD33-/CD19-细胞亚群，说明ALL原始细胞来源于造血干细胞阶段。
Cox等证实前B-ALL中的CD34+/CD10-/CD19-、T-ALL中的CD34+/CD4-和CD34+/CD7-细胞亚群可长期增殖。
这说明在这些例子中，更原始表型细胞是白血病转化的目标。
Viseur等发现在儿童ALL中，不同免疫表型阶段的细胞都可有干细胞特性。
研究者将这些不同免疫表型成熟度的细胞移植到NOD/SCID小鼠体内可完全重建白血病表型。
总之，ALL与AML干细胞特点不完全相同。
白血病干细胞靶向治疗
许多基因突变、分子异常和信号通路紊乱是导致AML产生的原因。
但关于这些异常是如何具体影响白血病干细胞知道得并不多。
白血病干细胞发挥维持疾病存在的作用，因此应该将研究重点放在增殖、自我复制和生存的通路上。
更明确点就是开发出靶向白血病干细胞生存通路而对正常造血干细胞损伤甚小的药物（如表1.2所示）。
白血病完全缓解后复发的主要原因是微小残留病灶（MRD）的存在。
例如，vanRhenen等近来发现特定免疫表型的AML干细胞在完全缓解后可在体内检测到，并且诊断时白血病干细胞数量与化疗后MRD数呈正相关，与患者生存呈负相关。
此研究说明MRD可在白血病干细胞水平检测。
表1.2白血病干细胞的靶向治疗药物
靶点药物
NF-κBMG-132
硼替佐米
DMAPT
TDZD-8
PI3K雷帕霉素
ET-18-OCH
法尼基蛋白转移酶BMS-214662
壁龛AMD3100
Anti-CD44
靶向白血病干细胞生存通路
白血病干细胞生存信号过强与异常的凋亡机制有关，调节这些异常信号通路可能成为清除白血病干细胞的有效方法。
在众多异常信号通路中，最重要的两条是NF-κB和PI3′-kinase/AKT通路。
未受刺激的造血干细胞不表达NF-κB，而AML干细胞持续表达NF-κB。
NF-κB是一种抗凋亡因子，使肿瘤细胞获得生存优势。
Guzman等[23]研究发现蛋白酶体抑制剂MG-123，通过稳定细胞IkB对NF-kB信号抑制，进而诱导CD34+CD38+AML细胞凋亡，对正常干细胞损伤甚小。
TD-ZD8是糖原合酶3b抑制剂，原用于治疗神经系统疾病，如Alzheimer’s，后被发现能抑制NF-kB活性。
它是一种非ATP的糖原合酶3b竞争性抑制剂，能抑制Cdk1/cyclinB、caseinkinase-II、PKA、PKC活性，从而介导细胞死亡。
Guzman等[24]发现TD-ZD8对原发性髓细胞白血病细胞、淋巴细胞白血病细胞等多种肿瘤细胞具有较强的杀灭作用。
在NOD/SCID小鼠体内重建白血病克隆的实验表明，TD-ZD8可以使其不再具有长期重建白血病的作用，而对正常造血克隆在NOD/SCID小鼠体内重建却没有影响。
哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路的丝氨酸-苏氨酸激酶，是PI3K通路的下游调节因子，控制细胞基因转录和分化。
PI3K/Akt/mTOR信号通路在人类白血病细胞中持续激活，使用PI3K或mTOR抑制剂联合阿糖胞苷和依托伯苷可诱导白血病细胞凋亡和减少LSCs的数量[25-26]。
磷酸酶张力蛋白同系物（PTEN）是一种负性调节PI3K的脂质磷酸酶。
在小鼠模型中，当它在造血干细胞缺失时，可引起以造血干细胞迅速增殖却失去自我更新能力为特征的MPD样综合征，并在六周内进展为AML或ALL[27]。
用雷帕霉素预处理后小鼠被敲除PTEN基因后不再发展为白血病，对于建立白血病的小鼠，雷帕霉素可以延长其生存期，抑制白血病细胞的增殖，并影响其在在NOD/SCID小鼠体内重建白血病克隆的效率[27]。
以上研究证实，雷帕霉素作为mTOR抑制剂可以根除PTEN缺失的LSCs。
雷帕霉素及其他mTOR抑制剂用于白血病治疗的临床试验正在进行。
靶向白血病干细胞表面抗原和微环境
运用抗体特异性作用于表达于细胞表面的分子是LSCs靶向治疗的一个重要策略。
CD33是一种表达于正常髓系单个核细胞和AML原始细胞的粘附蛋白，近年被发现也表达于部分AML-LSCs。
吉妥昔单抗，作为一种CD33的人重组的人源化单克隆抗体同时与细胞毒素连接，可诱导复发的CD33+AML再次缓解，在APL中可以清除微小残留病灶[28]。
吉妥昔单抗治疗作用中有部分是特异性杀伤CD33+的AML-LSCs。
CD123，即IL-3受体，是又一个表达AML-LSCs的分子标记。
JinL等报道针对CD123的抗体7G3在体外试验中选择性杀CD34（+）CD38（-）白血病细胞，降低AML在NOD/SCID小鼠体内重建的效率，提示其对LSCs有杀伤作用[29]。
CLL-1（C-typelectin-likemolecule-1）,是表达于许多LSCs表面功能不明的粘附分子[10]。
在正常骨髓中，它只表达于CD38+的髓系祖细胞，CD34+CD38—的干细胞不表达使之成为颇具吸引力的治疗靶点。
虽然联合常规化疗和新的靶向治疗能完全清除外周血的恶性肿瘤细胞，但骨髓中残留的微小残留病灶常成为日后复发的根源。
由此可见骨髓中的基质细胞必然对造血细胞的生存起保护作用。
基质细胞衍生因子（SDF-1）与它的受体CXCR4之间相互作用在引导LSCs在骨髓中迁移起重要作用。
TavorS等[30]研究SDF-1/CXCR4对于维持LSCs生物学特性保护其生存的作用。
用抗体先后阻断SDF-1和CXCR4的活性可缩短AML细胞的生存时间并削弱了AML原始细胞在NOD-
SCID小鼠体内重建白血病细胞克隆的能力。
因此，SDF-1/CXCR4信号通路是一个很有前景的LSCs治疗靶点。
VLA-4是表达于人AML细胞表面的一种蛋白，在骨髓微环境中介导白血病细胞与纤连蛋白、血管内皮细胞粘附分子-1的结合起重要作用。
Matsunaga等[31]研究发现在体外VLA4+AML细胞与纤连蛋白接触后激发PIK3-AKT细胞通路，从而使细胞避免化学药物的诱导凋亡；
给白血病克隆重建的小鼠体内注入VLA-4抗体和阿糖胞苷可清除其微小残留病灶。
CD44作为在LSCs过表达的粘附分子最近因为颇具希望的治疗靶点而成为大家关注的热点。
CD44是一种广泛存在的跨膜糖蛋白，能够连接透明质烷、骨桥蛋白，在器官发育、细胞归巢、细胞移动方面起作用[32]。
Jin等[33]最近研究发现将H90注射到获得人AML的NOD-SCID小鼠体内后，白血病负荷明显减小，且无法在其他NOD-
SCID小鼠体内重建白血病克隆[33]。
但正常造血干细胞或脐带血在NOD-
SCID小鼠的移植却不受H90的影响。
抗CD44抗体抗白血病作用机理之一是扰乱LSC与造血微环境之间的作用[33]。
靶向白血病干细胞自我更新信号通路
造血干细胞和白血病干细胞自我更新能力的调节机制目前知之甚少，仅有的知识是通过动物模型研究得来的。
自我更新的抑制可能导致白血病干细胞休眠而无的的毒性，同时有可能影响到正常造血干细胞。
另一方面，阻断自我更新使分化压力增加，从而有利于清除白血病干细胞成分。
基因Bim-1是在多种组织调节细胞生存的蛋白，其作用机制包括自我更新/增殖、移动/静止、细胞死亡的调节。
在人和小鼠，Bim-1都被证实只在非常原始骨髓细胞中表达。
Bim-1的表达对正常造血干细胞自我更新能力的维持至关重要。
另外，Bim-1在所有髓细胞白血病都有表达，包括CD34+的白血病干细胞群。
Bim-1缺乏的白血病干细胞和祖细胞增殖潜能受影响并不能在小鼠体内诱导出白血病，同时研究发现仅Bim-1基因可完全纠正细胞增殖潜能的缺陷。
这说明Bim-1基因直接调控着白血病干细胞的自我复制和增殖的能力。
因此，靶向白血病干细胞的Bim-1基因治疗可能产生奇特的疗效。
明白自我复制能力的分子调节机制关系到白血病和造血干细胞的生存问题是未来白血病干细胞靶向治疗的关键。
Wnt信号通路也在造血干细胞自我复制和增殖方面起到重要的作用，它及其下游效应通路被异常激活常见于白血病中。
这些研究发现提示Wnt信号通路是白血病转化中的一个重要环节，为白血病干细胞的靶向治疗提供帮助。
结论
白血病干细胞是肿瘤干细胞的典型代表，并且作为一模型让我们认识了肿瘤干细胞的一般生物学特性。
白血病干细胞在白血病发生中的核心作用已被确立。
它与正常造血干细胞有着共同的特征，但也有自己独特的一面。
两者之间的差异为靶向白血病干细胞治疗而正常造血干细胞损伤最小提供了可能。
第二节白血病的传统诊断方法
1急性白血病
急性白血病是一种以造血原始细胞恶性克隆性增殖，但向功能性粒、单、淋巴和红细胞分化受阻，以致大量非成熟或原始细胞大量蓄积为特征的恶性血液肿瘤。
依据原始细胞的来源，将其分为前B或T急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病，每一种都代表了一组高度异质性疾病。
原始细胞同时表达两种以上或更多系列抗原的白血病不常见，此时将其定义为急性混合细胞性白血病。
急性白血病患者的治疗决策依据为其精确的分类。
形态学检测对疾病的分类十分重要，另外其他的检验，如流式细胞仪检测免疫表型、细胞遗传学、分子基因检测也很常用。
目前WHO关于急性髓细胞白血病和前体淋巴细胞肿瘤分类分别如下2.1表所示。
除临床表现外，形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子检测对急性白血病的精确诊断至关重要。
急性白血病的诊断流程图如下。
2.1世界卫生组织的急性髓细胞白血病分类
具有特定细胞遗传学异常的ＡＭＬ
伴随t（8;
21）（q22;
q22）;
RUNX1-RUNX1T1的AML
伴随inv（16）（p13.1q22）或t（16;
16）（p13.1;
CBF-MYH11的AML
伴随t（15;
17）（q22;
q12）;
PML-RARA的AML
伴随t（9;
11）（p22;
q23）;
MLLT3-MLL的AML
伴随t（6;
9）（p23;
q34）;
DEK-NUP214的AML
伴随inv（3）（q21q26.2）或t（3;
3）（q21;
q26.2）;
RPN1-EVI1的AML
伴随t（1;
22）（p13;
q13）的AML
伴随NPM1突变的AML
伴随CEBPA突变的AML
骨髓增生异常综合征相关的AML
治疗相关性的AML
AML,非特指类
微分化型的AML
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