dna体外扩增技术总结Word文档下载推荐.docx

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1985年由美国Karray等学者首创了pCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。

随着科学技术的进展和突破，pCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。

pCR技术模拟DNA的自然 复制过程，基于DNA的半保留复制原理，其特异性依靠于与靶两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：

变性——退火——延长。

变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。

退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。

在此过程中，引物与单链DNA模板仍然根据碱基互补的方式配对。

延长是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTp为反应原料，举行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。

经重复循环变性——退火——延长3个过程，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一次循环需2～3min，2～3h就能将目的基因扩增、放大几百万倍。

普通单一拷贝的基因循环25～3O次，DNA可扩增100万～200万倍。

因为该技术具有较强的敏捷度，因为产物的生成量是以指数方式增强的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；

在病毒的检测中，pCR的敏捷度可达3个RFU（空斑形成单位）；

在细菌学中最小检出率为3个细菌。

同时对标本的纯度要求低，不需要分别病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织

等DNA扩增检测。

加之精确     度和特异性，又能迅速简便举行检测，因而其应用领域也在不断延长。

但因为其复制必需有引物做模板，故只能用于复制扩增及检测已有的DNA片段，使用上具有一定的局限性。

2.cDNA文库法

cDNA为具有与某mRNA（信使RNA）链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。

与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依靠RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依靠DNA的DNA聚合酶或依靠RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。

真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

在这种状况下，mRNA的cDNA，与本来基因的DNA（基因组DNA）不同而无内含子；

相反地对应于在本来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。

因为真核生物基因组DNA十分浩大，而且含有大量的重复序列，很难直接分别得到靶基因片段，而cDNA则来自反转录的RNA，不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分别得到相关基因。

同时因为RNA分子敏感坚强，自然状态下难以被扩增，因此为了讨论mRNA所包含的信息，普通将其反转录为稳定的双螺旋DNA分子（即cDNA）在插到自我复制的载体中即可。

此过程包含5个阶段：

（1）总RNA的提取。

细胞中总RNA包含mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA），一个典型的动物细胞总RNA含量中，rRNA占80%～85%，tRNA和sRNA约占15%～20%，而mRNA只占1%～5%。

同时因为mRNA为单链，简单受核酸酶袭击被破坏，因此要保证环境和试验器皿没有被RNA酶污染。

从而保证被提取物良好的存活率。

总RNA抽提办法有无数种，目前试验室常用的办法是用异硫氰酸胍—苯酚抽提法，使用Trizol试剂举行。

除此之外还有硅胶模纯化柱法等。

（2）mRNA的纯化。

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端的帽子结构和3’端的polyA尾巴，此结构为真核生物mRNA的提取提供了极为便利的挑选性标志。

实验中常用寡聚纤维素色谱柱法获得高纯度的mRNA，在高盐缓冲液下，mRNA被特异性结合到色谱柱上，再用低盐或蒸馏水洗脱，经两次色谱柱纯化后即可得高浓度mRNA。

目前许多商业试剂盒也可以用作mRNA的纯化，并且有相当好的效果。

操作简便，快捷

且敏捷度较高。

（3）cDNA的合成。

cDNA的合成包括第一链和其次链的合成。

第一链是一mRNA为

模版，在反转录酶的作用下反转录成cDNA.该酶和成DNA时需要引物引导，常用的引物为oligodT。

其次链cDNA的合成是以第一链为模板，以DNA聚合酶催化。

（4）cDNA文库的构建。

因为cDNA的长度普通在0.5～8kb，常用噬菌体类载体和

质粒做载体，将cDNA重组到载体上。

合成的cDNA与载体DNA举行衔接普通有3种办法：

①借助于末端转移酶的3'

-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'

-OH端分离加上均聚核苷酸链；

②双链cDNA和线性化载体DNA分离用KlenoRNA含量很低，很难用cDNA法克隆;

同时有些基因比较短，如：

生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等，采纳基因文库办法合成过程比较复杂而且时光成本比较高，相比采纳化学的办法合成成本更低，这就需要我们采纳化学的办法对其举行合成。

化学合成DNA的实质是根据序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：

基团庇护、分别、缩合、分别、去庇护五大操作单元。

同时DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5'

→3'

方向延长，而是由3'

端开头，其合成法的前提必需是已知目的基因的DNA序列，普通状况下化学合成的DNA片断普通局限在200bp以内。

从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；

详细操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。

目前，普通DNA合成都采纳固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此办法具有高效、迅速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。

其合成方式按照所合成DNA片段的大小普通分成三种：

（1）小片段粘接法：

分离合成12-15bp的单链DNA小片段。

片断之间有互补区，混

合退火形成有断点的双链，再由T4DNAligase衔接成完整双链。

（2）补钉延伸法：

分离合成12-15bp的单链DNA小片段及20-30bp的单链DNA中片

段。

片断之间有局部互补区，可互相作为另一个片断延伸的引物，用KlenoeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延长起点，通过变性、退火、延长等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能迅速特异地在体外扩增任何目的DNA。

可用于基因分别克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性讨论等许多方面[2]。

聚合酶链式反应技术（pCR）自1985年问世以来，以其敏捷性、特异性和迅速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。

近年来随着分子生物学的飞快进展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。

已经建立起来的办法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。

前者包括聚合酶链式反应（pCR）、链替代扩增（SDA）、衔接酶链式反应（LCR）和依靠核酸序列的扩增（NASBA）等，这些办法都具有很高的敏捷度。

信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕捉、侵染（Invader）

和通过扩增替代分子来检测靶核酸等办法。

而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的办法。

二、核酸等温扩增技术

等温扩增技术（IsothermalAmplificationTechnology）是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到迅速核酸扩增的目的。

近年新进展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比pCR技术更为容易便利，它挣脱了对精良设备的依靠，在临床和现场迅速诊断中显示了其良好的应用前景。

在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新进展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依靠解旋酶等温扩增、依靠核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸迅速等温检测放大等技术，也在不断进展与完美之中[3]。

1、链替代扩增技术

链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3’延长并置换下游序列的能力，在等温条件下举行扩增。

被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延长成双链。

该过程不断反复举行，使靶序列被高效扩增。

SDA的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTp以及钙、镁离子和缓冲系统。

囫囵过程由预备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。

2、滚环扩增技术

滚环核酸扩增（rollingcircleamolification，RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。

线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延长，产物是具有大量重复序列（与环状DNA彻低互补）的线状单链。

线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。

指数RCA原理与线性RCA相同，采纳与环状DNA序列彻低全都的其次种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延长，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时光

内，产物呈指数递增。

3、依靠解旋酶DNA扩增

依靠解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于2022年发明的一种新型核酸等温扩增技术。

该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，终于实现靶序列的指数式增长。

4、依靠核酸序列扩增

依靠核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、延续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程[4]。

5、环介导等温扩增

环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位举行碱基配对延长时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成[5-6]。

6、单引物等温扩增技术

单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由由3’端DNA部分和5’端RNA部分组成。

切割酶作用后裸露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去举行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的迅速扩增。

7、迅速等温检测放大技术

迅速等温检测放大技术最早由中科院讨论人员于2022年发明。

技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识别位点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针与目标基因序列杂交后形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在检测探针链切割，形成两小片段，小片段从目标序列脱落，另一DNA探针再与目标序列结合产生小片段，如此循环可得。

8、Qβ复制技术

Kacian等于1972年首次报道了Qβ复制酶（Q-betareplicase）催化RNA模板自我复制的功能。

Qβ复制酶是Qβ噬菌体产生的一种依靠于RNA的RNA聚合酶，以单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA，也可以指数式扩增重组DNA分子。

三、展望

核酸分子体外扩增是生物技术讨论的重要手段。

随着科学的进展和讨论目的不同，浮现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。

目前，基于pCR技术的检测办法是转基因检测的常规办法。

尽管传统pCR有着各种各样的优点，但在应用方面，还有其自身的缺点。

例如，循环中需要高精度的温度循环，扩增抑制剂对敏捷度的影响等，这些在转基因检测的应用中都是至关重要的。

等温扩增技术不需要高精度的热循环仪，十分适应于现场检测。

其他可挑选的核酸扩增办法在某些方面也弥补了传统pCR技术的不足。